2022 年度実施状況報告書

脳梗塞後のグリア瘢痕制御におけるセクレトームを介したマイクログリアの機能解析

研究課題

研究課題/領域番号	22K20693
研究機関	順天堂大学
研究代表者	木島千景順天堂大学, 医学部, 助手 (40710611)
研究期間 (年度)	2022-08-31 – 2024-03-31
キーワード	脳梗塞 / 軸索再生 / マイクログリア / グリア瘢痕 / セクレトーム
研究実績の概要	本邦における脳卒中の患者数は約112万人に達し、要介護となる原因疾患の第2位を占める。脳梗塞急性期では再灌流療法が普及したが、依然多くの患者が後遺症に苦慮している。我々は、梗塞後に軸索再生が誘導されるものの軸索再生阻害因子であるグリア瘢痕により軸索再生が抑制されることに着目し、瘢痕を構成するアストロサイトと、マイクログリアとの相互作用に着目した。既に先行研究で明らかにしたマイクログリアよる神経保護型アストロサイトの誘導、軸索再生及び慢性期の機能回復といった知見を基に、本課題では、マイクログリアが神経保護的なアストロサイトを誘導する機序について、セクレトームの側面から具体的な分子病態機構の解明を目指している。アストロサイトの活性化に関わるP2Y1受容体(Gタンパク共役型ATP受容体)の阻害薬、および虚血マイクログリア培養液を投与した虚血アストロサイトから得られた細胞外小胞（EVs）に含まれるmicroRNA-146a-5pがNFκBシグナル伝達を抑制し、炎症性サイトカインTNFαを抑制することで慢性期の機能回復が得られる事を明らかにした。アストロサイトの性質の評価に関し、神経傷害型または保護型について単一の分子のみならず、より網羅的に検討するためmRNA発現の再解析を行ったところ、P2Y1受容体阻害薬および虚血マイクログリア培養液を投与した虚血アストロサイトにおいては、複数の傷害型マーカーの低下と保護型マーカーの上昇を認めた。さらに、microRNA-146a-5p が抑制するTNFαによる、虚血後の軸索再生への効果を検討するため、in vitro において虚血後の神経細胞に対するTNFαの投与実験を行、濃度依存的に虚血後神経軸索再生を阻害することが明らかになった。今後は以上の知見をもとに、虚血マイクログリアのセクレトームの解析を行ってゆく。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由これまでの研究において、P2Y1阻害薬及び虚血後マイクログリア培地を投与したアストロサイト由来の細胞外小胞中ではmiR-146a-5pの発現が有意に増加し、CD9、CD63、CD81といった表面抗原も有意な発現増加を認めた。miR-146a-5p はTRAF6、IRAK1、NFκBを介しTNFαの産生抑制に寄与し、CD9、CD63、CD81などのテトラスパニンと呼ばれる膜タンパクは様々な疾患において抗炎症作用を有すると報告されている。よってそれらが軸索再生と慢性期の機能予後改善のメカニズムであると考えられた。これらの研究成果を論文化することを目指し、各種学術雑誌に投稿を行った。リバイスにて、in vivo及びin vitroの追加実験を多数行った。また、グリア細胞の機能については未だ不明な点が多くあり、その性質の評価方法の最新の知見も刻々と変化している事から、本研究におけるアストロサイトのマーカーの評価方法に関しても再検討を要した。この点に関しては、培養実験や免疫染色の追加が必要であり時間を要したが、mRNAの再解析により、先行実験の結果を裏付ける事ができた。これらの研究成果は、論文の執筆のみならず、各種学術学会で発表し、同分野の研究者と意見を交換する機会を得ることができた。
今後の研究の推進方策	マイクログリアがアストロサイトを制御する詳細なメカニズムを明らかにすることが本研究課題目的である。かつてマイクログリア及びアストロサイトは主に傷害型もしくは保護型に分類して論じられることが多かった。しかし、最近では各病態における両者の性質の変化は二極性ではなく、より複雑でグラデーションを示すと考えられている。本研究におけるマイクログリアの性質の評価も、アストロサイト同様に、網羅的に評価するために以下のアプローチを行ってゆく。＜In vitroにおける虚血マイクログリアのEVs及びサイトカインのアストロサイトへの作用の解明＞EVs解析：虚血マイクログリア培地からEVsを抽出し、microRNAの網羅的解析及びパスウェイ解析Ingenuity Pathway Analysis（IPA）によりグリア瘢痕制御、軸索再生に関わる分子メカニズムを同定する。候補となったmicroRNAに関してはNucleofectorTM2bを用いてノックダウンしたマイクログリアを培養し、EVsを抽出する。EXOVIEW-RT100TMを用いた粒子数、表面抗原(CD9,CD63,CD81)の発現を解析する。サイトカイン解析：サイトカインプロファイラーを用いた網羅的解析を実施する。＜マイクログリア由来のセクレトームの脳梗塞ラットへの治療応用＞8-9週齢の脳梗塞モデルラットに対し、peri-infarct areaにマイクログリア由来EVs、網羅的解析で同定されたmicroRNAをノックダウンしたEVsを投与する。脳梗塞ラットの神経徴候、運動機能を解析する。屠殺したラットの脳切片を免疫組織染色でグリア瘢痕の免疫組織学的解析を行う。
次年度使用額が生じた理由	本研究費の交付開始が2022年9月であったため、2022年度前半に行った実験び参加した学術集会の参加費用が含まれないため、次年度使用額が生じた。次年度に関しては、引き続き学術雑誌への投稿とリバイスに対応するための追加実験を行う。具体的には、In vitroにおける虚血マイクログリア培地からEVsを抽出し、microRNAの網羅的解析及びパスウェイ解析Ingenuity Pathway Analysis（IPA）を行う。さらにNucleofectorTM2bを用いてmicroRNAをノックダウンしたマイクログリアを培養し、EVsを抽出する。EXOVIEW-RT100TMを用いた粒子数、表面抗原(CD9,CD63,CD81)の発現を解析、マイクログリアのサイトカインプロファイラーを用いた網羅的解析を実施する。in vivoでは脳梗塞モデルラットに対し、peri-infarct areaにマイクログリア由来EVs、網羅的解析で同定されたmicroRNAをノックダウンしたEVsを投与する。脳梗塞ラットの神経徴候、運動機能を解析する。屠殺したラットの脳切片を免疫組織染色でグリア瘢痕の免疫組織学的解析を行う。同時に、最新の知見を得るために各種学術集会への参加を行う予定である。以上の実験および論文執筆、学術集会参加費用に使用する計画である。