| 研究課題/領域番号 |
22K20868
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| 研究機関 | 東京慈恵会医科大学 |
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研究代表者 |
佐藤 洋平 東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (50753349)
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| 研究期間 (年度) |
2022-08-31 – 2025-03-31
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| キーワード | 制御性T細胞 / NFKBシグナル / CRISPR /Cas9 / FOXP3 |
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| 研究実績の概要 |
ヒト末梢血からT細胞、並びに制御性T細胞を分離、NFKB1遺伝子並びにNFKB2遺伝子をCRISPR/Cas9を用いてノックアウトを行った。T細胞においては、NFKB1遺伝子並びにNFKB2遺伝子をノックアウトしても表現型に変化は見られなかった。制御性T細胞においては、NFKB1遺伝子をノックアウトしても表現型に大きな変化は見られなかったが、NFKB2をノックアウトした際にはFOXP3や関連遺伝子の発現が減少していた。そのため、制御性T細胞では非古典的NFKB経路が表現型の維持に関与している可能性が示唆された。
NFKB1並びにNFKB2タンパクはRELタンパク（RelA,RelB, c-Rel）と複合体を形成することで、シグナル伝達を司っていることが知られている。当初の計画ではNFKB1並びにNFKB2のみに着目する予定であったが、CRISPR/Cas9を用いたREL遺伝子（RELA ,RELB ,RELC）をノックアウトする事でNFkBファミリー遺伝子がどのように相互作用するかを検証することとした。CRISPR／Cas9によるNFkBファミリー遺伝子を網羅的にノックアウトする実験系を立ち上げ、セルラインやヒト末梢血から分離したT細胞、並びに制御性T細胞を用いた解析を行なっている。
当初は造血幹細胞を用いてNFKB1遺伝子並びにNFKB2遺伝子をCRISPR/Cαs9を用いてノックアウトする予定であったが、動物実験の開始に時間がかかり、in vitroでの造血幹細胞のノックアウトに関する実験系は立ち上げたものの、年度内に動物実験までは行うことができなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の予定では2年間のうちにNFKB1、NFKB2をノックアウトすることにより、in vitroおよびin vivoの両側からアプローチをする予定であった。in vitroに関しては当初予定していたよりも早く実験が進み、RNA-seqを含めた機能解析を終了した。一方で、in vivoにおいてはノックアウトの実験系は順調に立ち上げられたが、免疫不全マウスの導入と造血幹細胞のノックアウト・移植のタイミングが合わずに実験開始を見合わせている状況である。
しかしながら、他のNFkBファミリー遺伝子（RELA ,RELB ,RELC）をCRISPR/Cas9によりノックアウトする事で、NFKB1およびNFKB2以外のNFkBファミリー遺伝子が制御性T細胞の恒常性維持にどのように関与しているかを検証することとした。CRISPR／Cas9によるNFkBファミリー遺伝子を網羅的にノックアウトする実験系を立ち上げ、セルラインやヒト末梢血から分離したT細胞、並びに制御性T細胞を用いた解析を行なっている。
現時点ではNFKB2をノックアウトした時のような表現型に対する明らかな影響は見られないが、FOXP3遺伝子や関連遺伝子の影響が見られ、今後解析を進める予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
NFKB1およびNFKB2以外のNFkBファミリー遺伝子（RELA ,RELB ,RELC）をCRISPR/Cas9によりノックアウトする事で、NFKB1およびNFKB2以外のNFkBファミリー遺伝子が制御性T細胞の恒常性維持にどのように関与しているかを検証することとした。CRISPR／Cas9によるNFkBファミリー遺伝子を網羅的にノックアウトする実験系を立ち上げ、セルラインやヒト末梢血から分離したT細胞、並びに制御性T細胞を用いた解析を行なっている。
現時点ではNFKB2をノックアウトした時のような表現型に対する明らかな影響は見られないが、FOXP3遺伝子や関連遺伝子の影響が見られ、今後解析を進める予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初予定していた通り実験が進まず、次年度以降も追加実験が必要となってしまった。
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