| 研究課題/領域番号 |
22K20904
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
柴田 明子 国立研究開発法人理化学研究所, 脳神経科学研究センター, 特別研究員 (70964245)
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| 研究期間 (年度) |
2022-08-31 – 2025-03-31
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| キーワード | RTTモデルマウス / 皮質ネットワーク異常 / マクロイメージング / RabΔG経シナプストレーシング / シナプスの形態学的観察 / FingR |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、Rett症候群（RTT）モデルマウスを用い、PV＋細胞が皮質ネットワーク異常にどのように関わるのか明らかにし、新たな介入方法を考案することを目的としている。
課題1に関しては、4か月のRTTモデルマウスと野生型マウスを用いて、安静時暗所、運動時における皮質領域間のCaイメージングの比較を行った。
課題2①に関しては、FingRのAAV-DIO-PSD95.FingR-mNeonGreen、AAV-DIO-Gephyrin.FingR-mScarlet、DIO-TagBFP2、DIO-TagGFP2-CAAXをCamK2-Cre、PV-Cre、およびSST-CreマウスのM2領域に注入することで、各神経細胞の形態と樹状突起上におけるPSD95-FingR-mNeonGreen、Gephyrin-FingR-mScarletの観察を行った。また、免疫染色にてFingRと内在性のシナプス蛋白質との共局在を確認した。FingRの蛍光強度を維持しながら脳組織を透明化し、免疫染色でMeCP2発現細胞、MeCP2欠損細胞それぞれを識別しシナプス蛋白質を可視化するための条件検討を行った。
課題2②に関しては、2か月（発症前）、4か月（発症早期）、6か月（進行期）の異なる月齢のメスRTTモデルマウスと野生型マウスのM2にAAV-CamK2-Creを注入し、組み換え狂犬病ウイルス（RabVΔG)を用いた経シナプストレーシングを行うことで、M2錐体細胞への投射ニューロンの全脳マッピングを行い、その分布を2群間で比較した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
課題2②については、当初の計画調書のPV細胞ではなくM2の錐体細胞への投射ニューロンを解析を行っているが、異なる月齢のマウスを用いることで病態の進行によるトレーシング結果の変遷を解析することができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
課題2①については、最適化した条件でFingRベクターを注入し、脳を透明化してRTTモデルマウスにおけるMeCP2発現細胞、MeCP2欠損細胞のシナプス形態を比較する。細胞種特異的にFingRを導入することで細胞種ごとの観察を行う。取得した画像は画像解析ソフトImarisを用いて解析する。
課題2②については、得られた結果が再現性があるかサンプル数を加えて解析を続ける。さらに、皮質layerごとの錐体細胞に対する投射ニューロンについても解析し、疾患感受性の高い皮質layerの同定も目指す。
また、課題1でモデルマウスと野生型で有意な変化があった領域に対して、課題3の介入実験を行う予定である。介入方法としては当初のchemogeneticな方法の他にAAVを用いた ヒトMECP2遺伝子導入も検討している。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
課題1, 2②に関してはマウス個体数を増やして解析を進めていくための費用が必要である。課題2①に関しても、透明化試薬や免疫染色に用いる抗体、画像解析ソフト利用のために費用を使用する予定である。
課題3に関しては、課題1,2の結果から介入領域を決定するためまだ未実施である。課題3にかかる費用についても次年度に残している。
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