| 研究課題/領域番号 |
21F21380
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
大場 雄介 北海道大学, 医学研究院, 教授 (30333503)
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| 研究分担者 |
PANINA YULIA 北海道大学, 医学(系)研究科(研究院), 外国人特別研究員
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| 研究期間 (年度) |
2021-11-18 – 2024-03-31
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| キーワード | ACE2 / 一次繊毛 / SARS-CoV-2 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、SARS-CoV-2受容体ACE2について、基礎的な細胞プロセスやCOVID-19症状の重症度との関連を理解すること目的に、特に一次繊毛との関連性に着目して研究を進めている。最終的には、ACE2が繊毛に局在する分子メカニズムの解明、SARS-CoV-2とACE2の結合が繊毛に与える影響、高血圧・糖尿病病態がこれらにどのような影響を与えるのかの解明を目指す。
本年度、つまり研究開始から6ヶ月間の到達目標は、ACE2の細胞内局在を決定し、ACE2発現細胞と非発現細胞との違いを調べることであった。まず、ACE2の局在を研究するのに適したモデル細胞を決定した。いくつかの細胞株をテストした結果、ヒトBEAS-2B細胞株、マウス退治線維芽細胞株、マウス3T3細胞株が、繊毛の識別性およびACE2抗体に交差性から適したモデルであると判断した。次に、市販のACE2抗体を複数用いて免疫蛍光法を行ったところ、ACE2を検出できるのは一つのみであることが判明した。この抗体を用いて、ACE2が細胞膜に局在していることを確認した。また、ACE2を恒常的に過剰発現させたBEAS-2B細胞株を用い、元のACE2非発現BEAS-2B細胞株と比較したところ、細胞の構造、形状、細胞骨格に大きな変化があることを見いだした。さらに、ACE2の過剰により細胞形態が変化することが確認されたため、細胞接着を担う細胞膜タンパク質を探索し、その局在が変化する接着分子を同定した。一方、生きた細胞での局在を、蛍光タンパク質タグしたACE2で検討しようと試みたが、繊毛局在性は認められなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
調書に記載した計画に沿って研究を遂行できているため。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度免疫蛍光法に用いたACE2抗体には、認識部位がACE2のN末端のものとC末端のものが混在していた。したがって、全長のACE2タンパク質が実際に繊毛に局在しているのか否かを検討する必要である。現在、この疑問に答えるべく、ACE2タンパク質のスプライスバリアントをqRT-PCRで調査しているところである。また、スプライスバリアンとの細胞内局在を調べるためには、蛍光タンパク質タグを用いるのが効果的だが、ACE2-mCherryは繊毛に局在しなかったので、新しいプラスミドを構築中である。今後の予定としては、これらの疑問に答えるとともに、当初の計画通り、ACE2の繊毛・細胞膜への輸送経路を明らかにし、特に輸送経路にソートされる責任部位を同定する。その後、研究計画に従って、ウイルス粒子の結合がACE2やタンパク質輸送にどのように影響するかを調べるための、予備実験を開始する。特に、我々が同定した細胞接着分子は、最近SARS-CoV-2侵入のco-receptorであることが提唱されており、局在変化とウイルス感染の関係性も検討する予定である。
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