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2022 年度 実績報告書

ペプチド環化酵素SurEを用いた短鎖環状ペプチドの効率的合成法の開発

研究課題

研究課題/領域番号 22J13818
配分区分補助金
研究機関北海道大学

研究代表者

小林 雅和  北海道大学, 生命科学院, 特別研究員(DC2)

研究期間 (年度) 2022-04-22 – 2024-03-31
キーワード環状ペプチド / 生体触媒 / 生合成
研究実績の概要

環状ペプチドは、その特有な3次元構造から高い代謝安定性や標的特異性を有するため、中分子医薬品のシード化合物として注目を集めている。しかし、環状ペプチドの化学合成は反応制御が難しく、鎖状ペプチドの大環状化の際には、C末端残基のエピメリ化や競合する分子間縮合により収率が大幅に低下するなど供給面に多くの課題を抱えている。一方、我々はこれまでに、放線菌により生産される非リボソーム型環状ペプチドsurugamide類の生合成から新しいタイプのペプチド環化酵素SurEを同定し、詳細な機能解析により本酵素のペプチド環化触媒としての有用性を明らかにしてきた。そこで本研究では、固相合成法による鎖状ペプチド基質の効率的合成と、SurEによるペプチド環化反応を組み合わせた化学-酵素ハイブリッド合成法を開発し、環状ペプチドを高収率・高純度で迅速に供給できる合成手法の確立を目指した。今年度では、安価に入手可能なエチレングリコールを利用し、ペプチド固相合成を行うことで、多種多様な鎖状ペプチド基質を70%以上の高収率で調製できる合成手法を確立した。さらに、開発した合成法を駆使して基質ライブラリーを一挙に構築することで、SurEの基質選択性を網羅的に解析し、本酵素の基質N末端残基と配列中央残基に対する寛容な選択性、及び基質C末端残基に対する厳密な選択性を明らかにした。また、SurEの基質C末端残基選択性の発現に関与している部分構造を同定し、その部位に変異導入を施すことでSurEの残基選択性を改変することに成功した。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

安価に入手可能なエチレングリコールを用いた鎖状ペプチド基質の効率的合成法を確立したことで、SurEの基質選択性の解明研究を大きく進展することができた。また本研究をもとにSurEを生体触媒として開発する上での課題を同定することができ、今後の研究方針・研究目標を明確にすることができた。

今後の研究の推進方策

今回確立した手法で合成できる環状ペプチドの多様性をさらに拡張すべく、(1) SurEホモログの探索による高活性酵素の同定と(2)タンパク質エンジニアリングによるSurEの基質選択性の改変を計画している。ゲノムデータベースの検索結果から、600種以上のSurEホモログが存在することが判明しており、各酵素がそれぞれ異なった基質選択性を有することが示唆された。そこで、それらホモログ酵素の機能解析を進め、SurEと異なる基質選択性を有する有用酵素を同定することで、本手法により合成可能な環状ペプチドの多様性を拡張する。また、SurEを生体触媒として開発する上で大きなボトルネックとなっている「基質C末端残基に対する厳密な選択性」を克服すべく、本酵素の基質C末端残基認識部位に変異を導入し、基質選択性を拡張した変異体酵素を獲得することを計画している。具体的には、PCRを利用して基質認識部位にランダム変異を導入し変異体のライブラリーを構築したのち、現在確立中のスクリーニング系を用いて有用酵素を獲得する。

  • 研究成果

    (5件)

すべて 2023 2022

すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件) 学会発表 (3件) (うち国際学会 1件) 産業財産権 (1件)

  • [雑誌論文] Streamlined Chemoenzymatic Synthesis of Cyclic Peptides by Non-ribosomal Peptide Cyclases2023

    • 著者名/発表者名
      Kobayashi Masakazu、Fujita Kei、Matsuda Kenichi、Wakimoto Toshiyuki
    • 雑誌名

      Journal of the American Chemical Society

      巻: 145 ページ: 3270~3275

    • DOI

      10.1021/jacs.2c11082

    • 査読あり
  • [学会発表] Streamlined chemoenzymatic synthesis of cyclic peptides by non-ribosomal peptide cyclases2023

    • 著者名/発表者名
      Kobayashi, M., Fujita, K., Matsuda, K., Wakimoto, T.
    • 学会等名
      4th International Conference on Natural Product Discovery and Development in the Genomic Era
    • 国際学会
  • [学会発表] 非リボソームペプチド環化酵素を利用した環状ペプチドの効率的な化学-酵素合成法の開発2023

    • 著者名/発表者名
      小林雅和, 藤田慧, 松田研一, 脇本敏幸
    • 学会等名
      日本薬学会 第143年会
  • [学会発表] 非リボソームペプチド環化酵素WolJの基質選択性に関する研究2023

    • 著者名/発表者名
      市原凛太朗, 小林雅和, 藤田慧, 松田研一, 脇本敏幸
    • 学会等名
      日本薬学会 第143年会
  • [産業財産権] 環状ペプチドの効率的な化学-酵素合成方法2022

    • 発明者名
      脇本敏幸、松田研一、小林雅和
    • 権利者名
      脇本敏幸、松田研一、小林雅和
    • 産業財産権種類
      特許
    • 産業財産権番号
      2022-24966

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公開日: 2023-12-25  

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