| 研究課題/領域番号 |
21J20168
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究機関 | 筑波大学 |
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研究代表者 |
向山 海凪 筑波大学, 理工情報生命学術院, 特別研究員(DC1)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-28 – 2024-03-31
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| キーワード | タイトジャンクション / MA026 / 経皮吸収促進剤 / Claudin / クローディン / 環状ペプチド |
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| 研究実績の概要 |
シュードモナス由来の天然環状ペプチドMA026はイヌ腎臓上皮細胞MDCK IIで上皮細胞間接着構造であるタイトジャンクションを開口する活性を示すことが報告されており、経皮吸収促進剤の候補として注目されている。以前の研究より、MA026はタイトジャンクションの重要な構成タンパク質であるClaudin-1のVFDSLL領域へ結合することが示唆されているが、結合様式の詳細や結合後にタイトジャンクション開口を引き起こすメカニズムは不明のままである。本研究ではMA026のタイトジャンクション開口メカニズムの詳細な分子機構の解析を目的とする。
MDCK IIで発現している5種類のClaudinを全てノックアウト(KO)したタイトジャンクション構造を持たないqKO細胞株に各ClaudinファミリーまたはVFDSLL領域に変異を入れたClaudin-1を発現させた株を取得し、それらの細胞株に対して物質透過性実験を行うことでMA026とClaudinの相互作用を明らかにすることを目指す。今回、qKO細胞へ発現させるClaudinへ付加するタグを検討したところ、N末端側にMycタグを付加したClaudin-1が十分なタイトジャンクション形成能を示し、解析に適していることが明らかとなった。さらに今回取得したN末端Myc-Claudin-1発現細胞株では、MA026処理によるタイトジャンクション開口活性も確認できた。また、N末端にMycタグを付加した他のClaudinファミリーの発現プラスミドの構築を複数完了した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は、前年度に引き続きMDCK IIで発現している5種類のClaudinを全てノックアウトしたタイトジャンクション構造を持たないqKO細胞株を用いて各Claudinファミリー発現細胞株の取得を進めた。前年度までに、野生型Claudin-1やVFDSLL領域のアミノ酸を他のClaudinの配列に変更させたタンパク質を発現させた細胞株の取得が完了していた。しかしClaudinに付加したタグの種類によっては目的タンパク質が発現しているにも関わらず、TER（経上皮抵抗値）の上昇や高分子蛍光トレーサーの透過性の低下が見られずタイトジャンクション形成能が不十分であることが判明した。そこで、他のClaudinファミリーの発現株の取得にあたって発現確認用のタグの検討を行った。N末端にFlagタグを融合させたClaudin-1をqKO細胞に発現させた細胞株ではタイトジャンクション形成能が不十分であった一方で、Ｎ末端にMycタグをを融合させたClaudin-1発現株では野生株と同等以上のタイトジャンクション形成能を示した上で、MA026処理によるタイトジャンクション開口活性も確認できた。この結果から、発現Claudinに付加するタグはN末Mycが適当であると考え、今後N末端にMycタグを付加したClaudinファミリーの発現株を取得していく予定である。現在、Claudin-1の他に、Claudin-3, 11,15の発現プラスミドの構築が完了しており発現株の取得が進行中である。
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| 今後の研究の推進方策 |
来年度はClaudin発現株の取得を引き続き進めていき、順次、物質透過性試験を用いたClaudin変異によるMA026のタイトジャンクション開口活性への影響を検討する。得られた情報と併せて前年度得られた競合阻害実験の結果を基に元に結合モデルを作成し、MA026のタイトジャンクション開口の作用機構の考察をするとともに、活性の高いMA026類縁体を設計・合成する。
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