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Krt5発現細胞特異的にTrp53変異とCas9を発現するKrt5CreERT2/+:Trp53R172/+: LSL-Cas9マウスの膀胱内にPten・Kmt2cのsgRNAを発現するアデ ノ随伴ウイルス(AAV)を注入することによって、膀胱癌が発生することを確認したが、本モデルは腫瘍形成の頻度が低く、発生までに数か月か かるなど、疾患モデルとしては非効率的で実用性の面で難があった。その原因としては、生体内ではCre-LoxPシステムによる遺伝子組み換え、 ウイルス感染、CRISPR/Cas9システムによる遺伝子編集の効率が低いことが考えられた。そこで、より高効率に癌化させられる利便性の高い研 究モデルとしてオルガノイドを用いることを着想した。
尿路上皮オルガノイド培養系の樹立
Krt5陽性細胞にTrp53変異とCas9及びGFPの発現を誘導したマウスの膀胱を摘出し、回収した尿路上皮細胞からGFP陽性細胞を分別して3次元オル ガノイド培養を試みたところ、GFP陽性Krt5陽性細胞を起源とするオルガノイド (K5-mUrorganoid; Trp53R172H/+) の樹立に成功した。さらに オルガノイド培養下では生体内よりもはるかに効率的にAAVによる核酸導入が可能であることを確認した。またそれらをin vivo移植 (同所性・ 皮下・腎被膜下)することにより高率に膀胱癌が発生することを確認した。また、これらの腫瘍はsquamous differentiationを伴い、腫瘍内heterogeneityを有していることを確認した。またこれらの腫瘍では、Trp53 R172H/+ のWT alleleが消失し、LOH化しており、腫瘍形成に寄与して いる可能性があることが分かった。そこで、TCGA dataベースでもヒト膀胱癌ではTP53変異の多くでLOHとなっていることを確認した。今後、Trp53のstatusの違いにより、腫瘍形成能に差があるのか実証実験を予定している。
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