研究課題
本研究はヒストン修飾因子であるSETDB1が膵癌の維持・進行において果たす機能的役割を明らかにするため、Dual-recombinaseシステムによる膵癌モデルマウスを用いて膵発癌後の任意の時期にSETDB1をin vivoでノックアウトし、膵癌の維持・進行におけるSetdb1の機能的役割の解析を試みている。さらに、ヒト膵癌3次元培養システムを用いて患者の膵癌組織からオルガノイドを樹立し、これを用いてSETDB1がヒト膵癌の治療標的となりえるか検証している。上記目的を達成するために本年度は下記のように実施した。まず、作成したFlp/frtシステムで膵癌を形成し、タモキシフェン投与によりCre/loxpシステムでSetdb1をノックアウトできるPdx1-Flp; FSF-KrasG12D; Trp53 frt/+; FSF-Rosa26CreERT2; Setdb1flox/floxマウスの解析を試みた。タモキシフェンを投与して非投与群との比較を検討したが、十分な個体数に十分な量のタモキシフェンを投与してから、ある程度の期間比較し、解析することが困難であった。そのため、十分な個体数を確保して比較するためにこのマウスからオルガノイド、細胞株を樹立し、同所移植モデルを作成してからタモキシフェンを投与してSetdb1をノックアウトし、表現系を検討する方針とした。また、外科手術または超音波内視鏡下穿刺吸引法などで採取したヒト膵がん患者の膵がん組織から3次元培養システムを用いて複数の膵がんオルガノイドの樹立を行った。さらに、Crisper/Cas9システムによるSETDB1ノックアウト用のターゲットベクターを作成した。今後、樹立した複数のヒトオルガノイドを用いてこのベクターやSetdb1阻害剤を用いてSetdb1を阻害した際の表現型を評価する。
2: おおむね順調に進展している
Dual-recombinaseシステムを用いた膵癌モデルマウスを解析し、樹立したヒト膵癌組織からのオルガノイドの検討を行った。まず、Dual-recombinaseシステムによる膵癌モデルマウスを作成し、解析を行ったが、タモキシフェンを一定の期間投与して比較・検討するための十分な個体数を確保することはやや困難であった。十分な個体数を確保して比較するためにこのマウスからオルガノイド、細胞株を樹立して、同所移植モデルを作成してからタモキシフェンを投与してSetdb1をノックアウトして表現系を検討する方針とした。しかし、当初からオルガノイド、細胞株を樹立し、in vitroでSetdb1の機能的解析を行う予定であったため、多少の計画の修正は必要であったが、概ね計画に沿って進んでいる。また、外科手術または超音波内視鏡下穿刺吸引法などで採取したヒト膵がん組織から3次元培養システムを用いて膵がんオルガノイドの樹立を試みた。オルガノイドの樹立に成功したが、一部の症例で正常のオルガノイドが含まれている可能性が否定できないため、引き続き膵癌オルガノイドのみの選択に取り組んでいる。選択には時間を要するが、すでに過去文献を参考に選択方法を見出しており、概ね計画に沿って進んでいると考えられる。上記の通り、研究計画に解決すべき課題が生じたものの、解決策を導き出し、概ね研究計画を進めていくことができていると考えられる。
本年度は作成したDual-recombinaseシステムによる膵癌モデルマウスから細胞株、オルガノイドを樹立し、これらで作成した同所移植モデルの解析と樹立したヒト膵癌オルガノイドに対するSetdb1阻害効果の検証を目指して下記のように実施していく予定である。まず、Dual-recombinaseシステムによる膵癌モデルマウスからオルガノイド、細胞株を作成し、水酸化タモキシフェンを用いてSetdb1をノックアウトする。そしてその遺伝子発現や表現系をコントロールと比較する。また、野生型マウスに同所移植腫瘍を作成し、タモキシフェンを投与することで腫瘍でSetdb1をノックアウトし、その表現型（アポトーシス増加や膵癌の縮小など）を解析し、膵癌の維持・進行におけるin vivoでのSetdb1の機能的役割を評価する予定である。また、ヒト膵がん患者の膵がん組織から樹立した複数の膵がんオルガノイドを用いて、Crisper/Cas9システムによるSETDB1ノックアウト用のターゲットベクターやSetdb1阻害剤でSetdb1を阻害した際の表現型を評価する。これまでのマウスの検討から野生型p53を有する場合p53依存性のアポトーシスが生じることを見出していることから、樹立したオルガノイドの遺伝子変異、特にp53変異の有無に注目し、Setdb1阻害の効果とp53遺伝子変異の有無の相関関係についての検証も検討している。
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すべて 雑誌論文 (2件) (うち査読あり 2件、 オープンアクセス 2件)
Cancer Science
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Gastroenterology
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