| 研究課題/領域番号 |
21J21277
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究機関 | 神戸大学 |
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研究代表者 |
繁森 弘基 神戸大学, 人間発達環境学研究科, 特別研究員(DC1)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-28 – 2024-03-31
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| キーワード | CRISPR / DNAセンサ / 多項目検出 / マイクロアレイ / 変異解析 / 迅速診断 / 電気化学センサ / POCT |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、細菌・古細菌の獲得免疫機構として知られるCRISPR/Cas12システムが標的遺伝子に対して迅速かつ特異的に認識し、同時にssDNA切断を応用した信号変換を行うことに着目した。そして、CRISPR分子(Cas12及びssDNA)をマイクロ流路やFET等の電極センサアレイ上に修飾した迅速病原微生物同定技術の実現を目指す。本年度は研究開発の初期検討として、CRISPR/Cas12システムの溶液系における一本鎖DNA（ssDNA）に対する切断活性の評価及び、基板表面に修飾したssDNAに対する切断活性の評価を行った。
溶液系の検討において、CRISPR/Cas12システムは僅か15分で1 nM以上の標的二本鎖DNA（dsDNA）を認識し、ssDNAを無差別に切断することを確認した。また、このssDNAに対する切断活性は標的dsDNA配列の2塩基変異に対して高い特異性を有することが示された。
次に、カルボキシル基が導入された96ウェル表面に対し、5’末端を蛍光色素、3’末端をアミノ基で標識したssDNAをアミド結合によって修飾し、CRISPR-CasシステムがこのssDNAに対して、切断活性を有するのか調べた。その結果、100 nMの標的dsDNA存在下で、ssDNAに対する切断活性を由来とする96ウェル表面の輝度減少が確認できた。また、ssDNAの長さと96ウェル表面の輝度減少の関係性についても評価した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本年度においては、CRISPR/Cas12システムを活用するセンシング技術に新たに取りかかり、研究設備の立ち上げからスタートしたにも関わらず、CRISPR/Cas12システムを用いて、短時間で配列特異的な標的DNA検知を達成し、またssDNAを表面修飾した条件においてもコラテラル活性を介したシグナル検出を実現した。
しかしながら、これらの研究成果は先行研究等の再現実験の域を出ておらず、新規性のある研究成果は未だ得られていない。従って、「やや遅れている」と判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度の検討において、表面修飾したssDNAがCRISPR/Cas12システムの基質としての役割を果たすことが判明したため、次年度はまずCas12の表面修飾に取りかかり、これが酵素としての役割を果たすか検討する。
また、Cas12及びssDNAを同時修飾したセンサ表面を作製し、標的dsDNAの蛍光減少型検出を試みる。更に、本センサ表面をマルチアレイ化し、ワンポット型の多項目dsDNA検出及び変異解析が可能か調査する。
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