| 研究課題/領域番号 |
21J00663
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究機関 | 長崎大学 |
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研究代表者 |
福本 隼平 長崎大学, 長崎大学熱帯医学研究所, 特別研究員(PD)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-28 – 2024-03-31
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| キーワード | マラリア / マラリア原虫 / 肝内期 / ホストハイジャック / 脂肪滴 |
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| 研究実績の概要 |
ヒト病原体であるマラリア原虫は肝臓で爆発的に数を増やすことが知られている。肝内期原虫が急速に増加するためには、細胞膜成分として脂質分子を短期間で大量に必要とするが、原虫の脂質合成系だけでは必要量の脂質分子を供給することは難しいと考えられる。そのため、宿主細胞から脂質分子を原虫に供給するシステムが存在すると考えられる。この脂質分子の供給源の一つとして考えられるのが脂肪滴であり、原虫は脂肪滴の脂質供給システムを利用して増殖に必要な脂質分子を得ている可能性が高い。よって本研究では、肝内期マラリア原虫における急速な増殖に関わる分子基盤を明らかにするために、原虫と脂肪滴間での脂質分子の動態を調査する。まず初めに、脂肪滴量を人為的に変化させた肝細胞にネズミマラリア原虫（Plasmodium berghei）を感染させて、原虫の増殖速度を調査した。方法としては、①培地にオレイン酸を添加し脂肪滴量を増加させたHuh7細胞、または②培地に含まれる血清を減らして脂肪滴の発生を抑えたHuh7細胞にｍCherry発現スポロゾイトス感染させた。次に感染後18時間と24時間で細胞を固定した後、原虫の増殖を共焦点顕微鏡で解析した。結果、コントロール群と比較して、①と②の間で、原虫の増殖に有意な差は認められなかった。この結果は、人為的に脂肪滴量を変化させても、原虫の増殖に影響を与えないことを示唆している。また、宿主の脂肪滴成分を原虫が自身の増殖ために利用している場合、原虫の寄生胞膜（PVM）近傍に脂肪滴がリクルートされる必要があると考えられる。この仮説を確かめるため、脂肪滴が接触しているPVMと接触していないPVMの数をカウントしてその割合を算出した。結果感染から18時間、24時間の双方において、90%超のPVMに脂肪滴を接触していた。この結果は、原虫が宿主脂肪滴をリクルートしていることを示唆している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
本研究は国立感染症研究所との共同研究である。本研究で使用するネズミマラリア原虫は国立感染症研究所で培養しているため、実験者が当該機関で実験を行う必要がある。しかしながら、採用年度の一年目はコロナウイルス蔓延に伴う行動規制のため、当該機関への出張を行うことができなかった。このため、当初計画していた実験を計画通りに行えず、課題の遂行が大幅に遅れることとになった。
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| 今後の研究の推進方策 |
マラリア原虫が感染した肝細胞において、寄生胞（PVM）膜周辺に宿主由来脂肪滴がリクルートされることを観察する。リクルートの存在を確認するため、ネズミマラリア原虫（Plasmodium berghei）を感染させた肝細胞の脂肪滴を蛍光プローブで標識し、超解像共焦点レーザー顕微鏡を用いて詳細な局在観察を行う。また、感染細胞における脂肪滴の数や量の測定も行う。さらに、感染細胞における脂肪滴局在タンパクであるperilipin5（PLIN5）の局在を抗PLIN5抗体を使用して超解像共焦点レーザー顕微鏡にて観察する。これにより、脂肪滴の構成成分であるリン脂質膜がPVMを介して原虫側にとりこまれていることを明らかにする。次に、PLIN5を過剰発現する肝細胞株（Huh7、HepG2）における、原虫の増殖速度の定量を行う。PLIN5は脂肪滴からの脂肪酸の流出を阻害するタンパクである。このため、原虫が宿主脂肪滴から脂肪酸を取り込んでいた場合、PLIN5過剰発現細胞においてはその増殖が阻害されると予測される。PLIN5過剰発現株は、サイトメガロウイルス由来のプロモーターによりPLIN5を過剰発現するプラスミドを、Huh7、およびHepG2にリポフェクション法によりトランスフェクションすることで作成する。また、PLIN5のN末端にはGFPタグを付加しているため、ライブイメージングを利用した感染細胞における脂肪滴動態の観察も行う予定である。
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