| 研究課題/領域番号 |
22J22973
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究機関 | 東京理科大学 |
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研究代表者 |
多田羅 麻由 東京理科大学, 理工学研究科, 特別研究員(DC1)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-22 – 2025-03-31
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| キーワード | 生殖細胞 / エピゲノム編集 / クロマチン / 精子形成 / エピジェネティクス / 分化 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、エピゲノム編集技術を用いた胚性幹細胞から精母細胞への分化誘導法の確立を目的とする。哺乳類の精子形成では、減数分裂期へ移行する際に体細胞型の遺伝子発現プロファイルから精子形成期特有の遺伝子発現プロファイルへと切り替わる。申請者は、マウス精子形成をモデルにこの大規模な遺伝子発現変化が減数分裂移行期の段階的なクロマチン構造変化によってもたらされることを明らかにした。次に、この精子形成の進行に重要なクロマチン動態が生物種間で保存された現象なのかという点に着目した。さらに、種間で共通して精子形成の進行に重要な領域を標的に、人為的に体細胞分裂型から減数分裂型のクロマチン状態に編集することで、in vitroで減数分裂への移行を制御できるのではと考えた。
そこで本研究ではまず、抑制型及び活性化型のエピゲノム編集を同時に行う新規のエピゲノム編集技術の確立を進めた。本項目では、ddCas12aを用いたCRISPRoff法による抑制型およびdCas9を用いたCRISPRa法による活性化型のエピゲノム編集を行うためのプラスミドベクターを作製し、CRISPRoff、CRISPRa融合タンパク質の活性をレポーターアッセイにより評価する。現在までに、ddAsCas12aを用いたCRISPRoff法による抑制生のエピゲノム編集を行うためのプラスミドベクターを作製した。作製したCRISPRoffベクターをHEK293FT培養細胞にトランスフェクションし、抗HA抗体を用いたウェスタンブロッティング法によりCRISPRoff融合タンパク質の発現を確認した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の予定では、令和4年度にコモンマーモセットの精母細胞を用いてオープンクロマチン解析を行い、マウスとの比較解析から種間で共通して減数分裂期への移行に必須なクロマチン領域を同定する予定であった。しかし、当初の予定を変更し令和5, 6年度に実施予定であったddCas12aとdCas9を同時に用いて抑制型及び活性化型のエピゲノム編集を同時に行う新規のエピゲノム編集技術の確立を進めた。本項目では、ddCas12aを用いたCRISPRoff法による抑制型およびdCas9を用いたCRISPRa法による活性化型のエピゲノム編集を行うためのプラスミドベクターを作製し、CRISPRoff、CRISPRa融合タンパク質の活性をレポーターアッセイにより評価する。現在までに、抑制型のエピゲノム編集を行うためにHAタグが付加されたddAsCas12aを用いたCRISPRoff融合タンパク質を発現するCRISPRoffベクター、及びgRNAを発現するgRNAベクター、そして赤色蛍光タンパク質であるmKate2を発現するレポーターベクターを作製した。作製したCRISPRoffベクターをHEK293FT培養細胞にトランスフェクションし、抗HA抗体を用いたウェスタンブロッティング法によりCRISPRoff融合タンパク質の発現を確認した。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後、dCas9を用いたCRISPRa法による活性型のエピゲノム編集を行うためのプラスミドベクターを作製し、CRISPRoff、CRISPRa融合タンパク質の活性をレポーターアッセイにより評価する。また、エピゲノム編集の標的となる領域を同定するために、種間で共通して減数分裂期への移行に必須なクロマチン領域を同定する。減数分裂への移行を制御するクロマチン動態が、進化的に保存されているかを検証するために、霊長類であるコモンマーモセットの精母細胞を用いて同様の解析を行う。マーモセット精巣から減数分裂移行期を含む4つの分化段階（タイプB分化型精原細胞、プレレプトテン期精母細胞、レプトテン-ザイゴテン期精母細胞、パキテン期精母細胞）の細胞を分取し、オープンクロマチン解析(ATAC-seq)を実施する。マウスとの比較解析から、移行期に種間で共通して開閉状態の変化するクロマチン領域と、そこに結合し機能する転写因子等を推定する。
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