| 研究課題/領域番号 |
21J23221
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究機関 | 長浜バイオ大学 |
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研究代表者 |
梅田 知晴 長浜バイオ大学, バイオサイエンス研究科, 特別研究員(DC1)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-28 – 2024-03-31
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| キーワード | ポリリン酸 / 出芽酵母 / 分裂寿命 / 細胞増殖 |
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| 研究実績の概要 |
ポリリン酸は、細菌からヒトにまでみられる数個から数百個の無機リン酸が連なった高エネルギー貯蔵体であるが、近年、様々な細胞機能の調節に関与することも報告されている。申請者のグループは、出芽酵母でポリリン酸を高度に蓄積させると、分裂寿命（一つの細胞が死ぬまでに生む細胞の数）が短くなることを見出した。ポリリン酸を合成するポリリン酸ポリメラーゼVtc複合体とポリリン酸を分解するポリリン酸ホスファターゼPpn1とPpn2は液胞に局在し働くが、興味深いことに、細胞質に局在するポリリン酸ホスファターゼPpx1もある。VTC5遺伝子の過剰発現によるポリリン酸高蓄積株は短寿命であり、この株でPPN1遺伝子あるいはPPX1遺伝子を過剰発現させると、どちらも分裂寿命が回復した。本研究は、細胞質ポリリン酸の増加が分裂寿命に悪影響を与えるという仮説を検証し、ポリリン酸の蓄積による短寿命の原因を明らかにすることを目的とする。
細胞質にポリリン酸を増加させるために大腸菌ポリリン酸キナーゼEcppk1遺伝子を発現させた酵母株は顕著に短寿命となり、細胞増殖が遅くなった。この株の短寿命に関係する因子を知るために、増殖遅延を指標として多コピーで抑圧する遺伝子のスクリーニングを実施し、ミトコンドリアの膜間腔輸送に関与するTIM9遺伝子を同定した。TIM9遺伝子の過剰発現によりEcppk1発現株の短寿命も抑圧された。また、細胞質ポリリン酸の増加による細胞内変動を知るために、Ecppk1発現株におけるRNA-seq法を用いたトランスクリプトーム解析を実施し、Ecppk1発現株でメチオニンおよびシステイン代謝遺伝子の転写量が増加していることを見出した。今後、細胞質ポリリン酸とTim9タンパク質の相互作用、およびEcppk1発現株のメタボローム解析による代謝変動を調べ、細胞質ポリリン酸の増加による短寿命の原因を推定する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
2021年度は、以下の3つの実験を実施した。
1）細胞質ポリリン酸の定量：超遠心分離機を用いた細胞分画によるポリリン酸定量法の確立を目指したが、確立には至っていない。問題点として、ポリリン酸高蓄積株では液胞が肥大化し、細胞破砕時に液胞が容易に破裂するために、微量な細胞質画分のポリリン酸を厳密に定量することが難しかった。
2）Ecppk1遺伝子発現株の短寿命を抑圧する遺伝子の探索：分裂寿命の測定は時間がかかるため、スクリーニングの指標には適さない。そこで、Ecppk1遺伝子発現株が示す増殖遅延を指標として抑圧遺伝子のスクリーニングを実施した。Ecppk1遺伝子発現株に酵母多コピーゲノムライブラリーを導入し、正常な増殖に回復するクローンを探索すると、ミトコンドリアの膜間腔輸送を担うシャペロンTIM9遺伝子を同定した。TIM9遺伝子の過剰発現によりEcppk1遺伝子発現株の短寿命が野生型株程度にまで回復した。Tim9と複合体を形成するTim10の過剰発現によっては増殖遅延も短寿命も抑圧されなかった。TIM9遺伝子の過剰発現は、ポリリン酸を高蓄積するVTC5遺伝子過剰発現株の短寿命も抑圧した。以上の結果より、Tim9がポリリン酸の増加と短寿命の関係を説明する重要な因子であると考える。また、酵母ノックアウトコレクションを用いてEcppk1遺伝子の発現による増殖遅延を抑圧する変異をいくつか同定している。
3）細胞質ポリリン酸増加株のオミックス解析：Ecppk1遺伝子発現株におけるRNA-seq法によるトランスクリプトーム解析を実施した。Ecppk1遺伝子の経時的な発現増加に伴い、メチオニンおよびシステイン代謝関連酵素遺伝子の転写量が増加していることを見出した。この結果は、細胞質ポリリン酸の増加により細胞内の代謝が変動することを示唆するものである。
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| 今後の研究の推進方策 |
TIM9遺伝子がEcppk1遺伝子発現株の短寿命を多コピーで抑圧したことから、今後、Tim9に注力して解析を進める。TIM9遺伝子はミトコンドリア膜間腔に局在するトランスロカーゼをコードしており、生育に必須の遺伝子である。今後、ポリリン酸がミトコンドリアでのTim9の機能に影響を及ぼすことを知るために、Ecppk1遺伝子発現株におけるTim9の細胞内局在や、ポリリン酸との結合能について調べることを計画している。また、Ecppk1遺伝子の発現による増殖遅延を抑圧する変異については、短寿命を回復させることを確認した後、TIM9遺伝子と同様の解析を進めたい。
Ecppk1遺伝子発現株のトランスクリプトーム解析によりメチオニンおよびシステイン変動のヒントが得られたため、今後、メタボローム解析によりメチオニン代謝の変動を確認するとともに、メチオニン以外に変動した代謝産物があれば同定する。これらの代謝に関与する遺伝子を破壊あるいは過剰発現することにより、これらの代謝が分裂寿命に関与するかどうかを調べる予定である。
超遠心分離機を用いた細胞分画法による細胞質ポリリン酸定量が困難なことから、今後、細胞質ポリリン酸の増加を証明する手法を考え直す必要がある。その一つとして、電子顕微鏡観察によるポリリン酸尾細胞内局在の検出を検討する。
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