研究課題
本研究は、シロイヌナズナにおいて少数の細胞もしくは核から、全ゲノム規模のDNAメチル化解析を行い、ストレスによって誘導されるエピジェネティックな修飾の確立過程を捉えることを目的とした。しかし、RNAと違ってDNAは1細胞あたりのコピー数が非常に少な く、これまでは技術的に困難であった。そこで、シロイヌナズナの卵細胞をモデルケースとし、細胞壁分解酵素でプロトプラスト化して単離・回収した少数の卵細胞からのDNAメチル化解析の技術改良と、卵細胞DNAメチル化プロファイルの詳細な解析を行った。研究代表者は、これまでもバイサルファイト法を用いて卵細胞の全ゲノムメチル化解析を実施していたが、得られたリードのマップ率が低く、改良が必要であった。そこで、近年開発された「酵素変換法」による解析も試みた。酵素変換法は、TET2およびAPOBECと呼ばれる2つの酵素を使い、非メチル化シトシンをウラシルに変換することで、シトシンにおけるメチル化の有無を判定する方法である。バイサルファイ ト法に比べて穏やかな条件で反応を行うことができるので、DNAの分解が少ないとされている。その結果、バイサルファイト法に比べて高いマップ率が得られ、 シーケンスデータあたりのゲノムカバー率も高かった。さらに、卵細胞で発現しているメチル基転移酵素の変異体からも卵細胞を回収し、シーケンスを実施した。しかし、今回試した、酵素変換法をベースとした新規のライブラリ作製方法には問題点があることも明らかになったため、さらなる検討が必要である。また、地上部においてDNAメチル化関連遺伝子の発現レベルに影響を与える貧栄養条件も見出しており、今後はその条件における茎頂分裂細胞や卵・精細胞のDNAメチル化パターンの変化についても解析する予定である。
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Plant Chromatin Dynamic: Methods and Protocols, 2nd edition.
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