| 研究課題/領域番号 |
21J01369
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究機関 | 沖縄科学技術大学院大学 |
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研究代表者 |
真野 智之 沖縄科学技術大学院大学, 沖縄科学技術大学院大学, 特別研究員(PD)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-28 – 2024-03-31
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| キーワード | 組織透明化 / 頭足類 / 全脳アトラス / 空間発現解析 / 光シート顕微鏡 |
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| 研究実績の概要 |
頭足類（イカ・タコ・コウイカ）は無脊椎動物の系統の中では最大級の中枢神経系を有する．頭足類の示す複雑な行動は，高度な視覚処理や記憶を要する哺乳類のそれと非常に似通っており，神経システムの収斂進化が示唆されている．したがって，頭足類の神経回路を比較生物学的な視点により調べることは神経システムの普遍的なモデルを探索するうえで大変有意義であると考えられるが，頭足類の脳神経回路の理解は未発達である．本研究の目的は，組織透明化法とライトシート顕微鏡イメージングという二つの最新の技術を用いることで，頭足類の全脳を高精度に三次元スキャンし，頭足類の脳解剖学的な理解を現代的な水準に導くことである．本年度の研究ではこの目標を達成するため次の課題に取り組んだ．(1) FISH (Fluorescence in situ hybridization) を用いて遺伝子の空間的発現を解析する準備段階として，イカ (Sepioteuthis lessoniana) のゲノム配列の解読を行った．また組織からの RNA シークエンシングのデータを用いて遺伝子のアノテーションを行った． (2) 先述の新規ゲノム情報を利用して FISH のプローブの設計と合成を行った．特に， HCR (Hybridization chain reaction) と呼ばれる反応に基づく FISH 法を導入し、高感度でイカの脳から遺伝子を検出できることを確認した． (3) 三次元 whole-mount FISH によってイカ全脳を染色する方法の検討を行った．総じて，イカ脳の空間的な遺伝子発現を解析するための要素技術を確立することができた．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
本年度は，前年度の研究に引き続き，イカ脳の遺伝子の空間発現を三次元で開発するための手法の検討に取り組んだ．前年度まではホールマウントの免疫染色でこれを実現することを検討していたが、いくつかの問題点によりこの方針は棄却された．代わりに， FISH (Fluorescence in situ hybridization) に基づく三次元の遺伝子空間発現解析の検討を始めた．特に， HCR (hybridization chain reaction) と呼ばれる反応機構に基づいた FISH を用いることで，高い選択性とシグナル強度を実現しながら，安価にプローブを作成できることが確認された．現在はこの HCR-FISH 法を透明化と組み合わせ，全脳スケールでmRNAを可視化する方法を検討している．
また，所属研究室内でのコラボレーションの研究も大きな進展があった．ここでは， Neuropixels と呼ばれる高密度電極をタコの脳に挿入し神経細胞から記録を取る実験において，記録した電極の場所を脳を固定後に同定する実験・解析を行った．電極に蛍光色素をつけておき，記録後の脳を固定した後，本研究で開発した透明化法で脳を透明化し，ライトシート顕微鏡で画像を取得した．さらに三次元の脳画像を重ね合わせるアルゴリズム(レジストレーション)を用いることで複数の記録を標準アトラス空間にマッピングした．これにより複数の脳領域における神経の活動レベルの違いを定量的に解析することに成功した．
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| 今後の研究の推進方策 |
最終年度となる三年目の研究では， HCR-FISH による三次元の遺伝子発現解析をイカの脳で実現することを目指す．手法の詳細の検討と最適化は最終段階まで来ており，数か月のうちに開発が完了できると見込んでいる．この手法を用いて，約100種の重要遺伝子の空間発現を解析する．ターゲットの遺伝子の選択には、近年ほかのグループから発表された一細胞RNAシークエンシングのデータを用い，細胞種のマーカーや神経伝達物質に関連する遺伝子を網羅的にターゲットする．また，同じ三次元FISHの方法を利用して immediate early genes (IEGs) の解析を行う．IEGs とは，神経細胞の発火頻度に伴って発現が上昇する遺伝子群の総称であり，IEGsの発現量をFISHで測ることで固定された脳組織から，固定される直前の神経活動の様態を計測することができる．IEGsにはc-Fos, EGR, CREB などの遺伝子が知られ，進化的に保存性が高い．IEG の空間発現を解析することで、外界の刺激や動物の行動に伴って反応する脳領域を網羅的に同定する実験を計画している．
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