研究課題
I 赤痢菌エフェクター機能と標的宿主因子の包括的解明 : 今年度解析したエフェクターに関して以下の知見を得た。(1)赤痢菌感染に応答してカスパーゼ4依存的な細胞死が誘発されたが、赤痢菌は抗カスパーゼ4活性を有するエフェクターを分泌して細胞死を抑制していることを発見した。(2)赤痢菌のマクロファージ感染に伴う炎症性細胞死に関わる新規宿主因子及びNLRインフラマソームを同定した。(3)赤痢菌の細胞侵入に伴いPKC活性化を介してNF-κBの活性化が誘導されたが、菌はE3リガーゼ活性を有するエフェクターを分泌してPKC-NF-κB経路の因子であるTRAF2を標的にしてユビキチン化修飾して、炎症誘導を阻止することを解明した。II. 赤痢菌自然感染マウスモデルの開発 : 前年度にはTecpr1-KOマウスは赤痢菌の自然感染モデルとして有効であることを確認した。そこでBALB/cマウスへの抗生剤投与により腸内細菌叢を変動させた群では、抗生剤未処理投与マウス群に比べ、腸管での著しい定着菌数増加および腸管粘膜剥離、炎症細胞増加が確認された。今後は赤痢菌易感染性に関わる腸内細菌叢および腸内代謝物を解明する。III. エフェクター機能阻害剤の同定 : 赤痢菌を含む広範囲のグラム陰性病原細菌が産生するIpaHファミリーに共通するユビキチンリガーゼを標的とする阻害化合物を同定する目的で、東大創薬オープンイノベーションセンターの化合物ライブラリーに対し、大規模・高効率スクリーニングを実施した。本年度は得られたヒット化合物を用いてIpaH活性阻害能(IC50)を測定し、さらにスクリーニング系とは異なる評価系を用いて精査し、阻害活性の強い化合物を得た。さらに得られた候補化合物のIpaH機能阻害特異性を調べるために、IpaHファミリータンパク質2種類、ヒトのユビキチンリガーゼに対する阻害活性を比較した。今後、より良いリード化合物を得るために、IpaHと化合物との相互作用様式をビアコアシステムや等温滴定熱測定(ITC)を用いて精査する。
2: おおむね順調に進展している
本研究では、赤痢菌の感染初期に必須なマクロファージ破壊に関わるNLRインフラマソームを同定し、それによる細胞死誘導メカニズムを明らかにした(PLos Pathog 2014)。また、赤痢菌の上皮細胞内増殖に対する免疫応答としてカスパーゼ4に依存した細胞死誘導が認められたが、赤痢菌はカスパーゼ4阻害活性を有するエフェクターを分泌して、細胞死を阻止し感染細胞を維持していることを明らかにした(Cell Host Microbe 2013)。さらに赤痢菌はE3リガーゼ活性を有するエフェクターを分泌してPKC-NF-κB経路の活性化に関わるTRAF2を標的にして炎症を抑制していることを明らかにした(PLos Pathog 2013)。一方、昨年度に報告したUBC13を標的にしてTRAF6-NF-κB経路を阻害するエフェクター、OspIとUBC13の共結晶化に成功した。その結果、OspIがUBC13を認識する分子機構を明らかにした(JMB2013)。赤痢菌の自然感染モデルの開発を目指して、前年度にはTecpr1-KOマウスによる感染モデルとしての必要条件を検討した結果、BALB/cマウスに3剤投与して腸内細菌叢を変動させた群においては、赤痢菌の腸管下部への定着と粘膜炎症の誘導が認められた(未発表)。オートファジー不全の一部は肥満に関わることも知られている。興味あることに、我々がオートファジー関連因子として同定したTecprl-KOマウスも、高脂肪食で飼育すると6週齢以降野生型マウスに比べて肥満が顕在化し、血中の血糖値、インスリンレベルが上昇していた。今後、Tecpr1-KOマウスの肥満原因となる臓器及びインスリンシグナル伝達への影響を精査する。IpaHファミリーのE3リガーゼ活性を標的とする阻害化合物の大規模スクリーニングを、東大創薬オープンイノベージョンセンターの化合物ライブラリー用いて行った。さらにIpaHファミリー2種類を用いて、スクリーニング系とは異なる評価系で強い阻害活性を示す化合物を得た。今後、赤痢菌感染細胞レベルで阻害効果を評価する。
赤痢菌の未知エフェクターについては、今後はE3リガーゼ活性を示すIpaHファミリーの3種類を重点的に精査して、これまでに明らかにしたIpaHファミリー全体の赤痢菌感染における役割分担を明らかにする。現在、IpaHファミリーの一つが、マクロファージにおいてNLRインフラマソームを活性化して細胞死を誘導する役割を担っていることを明らかにした(PNAS in revision)。このエフェクターの標的宿主因子として新規な宿主因子を同定した。今後この宿主因子の機能解析を通じてNLRインフラマソームに対する負の制御機構を解明する。Tecpr1-KOマウスによる赤痢菌の自然感染モデルを確立するためにTecpr1-KOマウスを3剤の抗生剤で処理を行った。この薬剤処理により変動する腸内ミクロビオータの変動を網羅的に解析して、その因子を明らかにする。また、赤痢菌の種々弱毒変異株を用いて、自然感染モデルとしての有効性を検証する。昨年度に得られたIpaH活性阻害化合物のなかで、IpaHファミリーの2種類のエフェクターのE3リガーゼ活性とヒトのE3リガーゼ活性に対する阻害活性を比較検討して選別された化合物から、今後より阻害活性と基質特異性の高いリード化合物を選び、赤痢菌感染細胞に対する細胞応答を精査する。また結果を統合して、赤痢菌感染抑制効果を示すリード化合物を設計する。
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すべて 雑誌論文 (7件) (うち査読あり 5件) 学会発表 (4件) (うち招待講演 1件) 備考 (1件)
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http://www.ims.u-tokyo.acjp/saikan/index.html
