| 研究課題/領域番号 |
23229001
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
堅田 利明 東京大学, 薬学研究科(研究院), 教授 (10088859)
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| 研究期間 (年度) |
2011-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | シグナル伝達 / 生体分子 / Ｇタンパク質 / Ｇサイクル |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、これまでに解析の進んだ既知タイプとは異なるGTP結合待機型とユニークな構造のマルチ・ドメイン型を対象に、新奇Ｇサイクルの時空的起動制御と新たな存在様式・作動原理の解明に向けて、精製蛋白質標品を用いた生化学的解析、細胞レベルでの分子生物学・細胞生物学的解析、さらにモデル生物の遺伝子破壊による表現型解析などから統合的に研究を進めて以下の知見を得た。
１．リソソームと後期エンドソーム、ファゴソームとの融合過程に介在するARL8の機能解明に向けて、相互作用する因子群を探索し、ARL8のGTPアーゼ活性を促進するGAPの存在を組織抽出液中に同定した。ARL8a、ARL8bのノックアウトマウスを作出し、ARL8bノックアウトマウスの樹状細胞において、Toll様受容体刺激を介した炎症性サイトカイン・I型インターフェロンの産生が顕著に減弱すること、また、ARL8bノックアウトマウスの胚発生期において、脳の形態形成が異常となることを認めた。
２．線虫の神経前駆細胞は、大腸菌を与えると活性化して分裂や分化が進むが、大腸菌の代わりにアミノ酸と脂肪酸合成を促進するエタノールを同時に与えると、神経前駆細胞が静止期から離脱して活性化すること、また、エタノール存在下で、アミノ酸を与える代わりに、ヒトのRagA/Bオルソログである線虫RAGA-1の恒常活性化体を神経前駆細胞に隣接する表皮で過剰発現すると、mTORC1活性依存的に神経前駆細胞を活性化できることを見出した。
VII型コラーゲンを小胞体から分泌経路へと送り込む積み荷受容体として機能するcTAGE5/TANGO1複合体を先に同定したが、この複合体がcTAGE5を介してArfファミリーＧ蛋白質Sar1のGEFであるSec12と結合し、ER exit siteへのSec12、Sar1の効果的な局在化に寄与することを見出した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
研究実績の概要に示したように、本研究で解析対象とした新奇Ｇ蛋白質群に関して、それらの活性調節因子群と新しい機能をいくつか見出せたことは大きな進展である。また、共同研究から、ヒトのがん化に関わるRhoファミリーＧ蛋白質のある遺伝子変異は、グアニンヌクレオチド交換反応を恒常的に促進してGTP結合型に転換させることを見出したが、この点変異体は、本研究で解析対象としたGTP結合待機型の様相を呈する新奇低分子量Ｇ蛋白質とも考えられる。
線虫Ragの介在する神経前駆細胞の栄養応答シグナル伝達経路において、マイクロRNA miR-235を含む複数因子の介在を同定したことは大きな成果であり、これらの因子群とＧ蛋白質RAGの活性調節機構との関連についての解析が引き続き可能となった。
他方、ER exit siteへのSec12の効果的な濃縮・局在化によるArfファミリーＧ蛋白質Sar1の活性化という機構の存在は、Ｇサイクルの時空的起動制御の視点から興味深い成果と考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
GTP結合待機型のＧ蛋白質の多くは細胞膜に結合しており、界面活性剤によって生体組織から可溶化した際には、その疎水的性状から多くの蛋白質と非特異的に結合してしまい、精製に際して困難を伴う場合がある。最近、Arl8からGTPを解離させてGDP結合型へと転換して細胞膜から遊離させる方法を考案し、カラムクロマトグラフィーによる高純度の精製を可能とした。この精製法は、別種のGTP結合型Ｇ蛋白質にも有用であると考えられるため、それらに適用する予定である。
新奇Ｇ蛋白質のグアニンヌクレオチド結合やGTPアーゼ活性の特性を変化させるものを、引き続き培養細胞やラット組織の抽出液から探索する。哺乳動物での解析に向けては、ARL8a、ARL8b等のノックアウトマウスにおいて見出した表現型が、個々のＧ蛋白質の機能とどのように関連しているかの解析を進める。
線虫神経前駆細胞での静止期からのin vivo活性化経路において、Ragヘテロ二量体Ｇ蛋白質が関与するアミノ酸応答現象を今回見出すことができた。これをバイオアッセイ系として、既存のRag活性化調節因子群の寄与や、新規のRag活性化調節因子について、遺伝学的手法あるいは酵母ツーハイブリッド法などの分子生物学的手法を用いた探索を進める。
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