研究課題
本申請研究では、８位置換プリン誘導体で駆動可能なリボスイッチを創成し、リボスイッチリエンジニアリングの原理理解を目的として、２）８位置換プリン誘導体の化合物ライブラリー作成、１）アプタマー部位を部分ランダム化したプリンリボスイッチDoped-RNAライブラリーの構築とインビトロセレクション、３）８位置換プリン誘導体により駆動される新規リボスイッチRNAの創成を検討した。平成25年度は、大腸菌にDoped-RNAライブラリーをプラスミドとして導入し、化合物存在下リボスイッチ機能がオンになるRNA配列を、レポーター遺伝子の発現により選択する事を試みた。細胞への導入、セレクションを計画通りに進めたが、中間結果から結合するRNA配列が収束しない可能性が高いという結果を得た。当初予定していた細胞培養、セレクション条件を変更する必要が生じ、研究期間を一年間延長して研究を進めた。大腸菌in vivoセレクションの対象化合物として、8-(2-aminopyridine-4-yl)adenine（FT332）を選んだ。プリンリボスイッチDoped-RNAライブラリーの下流にカナマイシン耐性遺伝子と蛍光タンパク質（ZsGreen）を組み込み、Lacプロモーターで発現を制御した。まず、化合物（－）条件でZsGreenが発現するクローンZsGreen(+)を、セルソーターにより除き、FT332存在下でカナマイシンプレート上にコロニーを形成するクローンを選別した。カナマイシン濃度を10 ug/mLと12.5 ug/mLで、200 uMのFT332を含むM9 mediumでセレクションを行い、それぞれ40クローンを選別したが、FT332存在下でZsGreenの蛍光強度が顕著に上昇するクローンを選別し、評価した。
26年度が最終年度であるため、記入しない。
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すべて 雑誌論文 (16件) (うち査読あり 16件、 オープンアクセス 1件、 謝辞記載あり 5件) 学会発表 (12件) (うち招待講演 5件)
Bioorg. Med. Chem. Lett.
巻: 23 ページ: 753-758
10.1016/j.bmc.2014.12.062.
巻: 24 ページ: 394-396
Chem. Eur. J.
巻: 20 ページ: 5244-5252
10.1002/chem.201304683.
巻: 24 ページ: 3578-3581
10.1016/j.bmcl.2014.05.042.
Bull. Chem. Soc. Jpn.
巻: 87 ページ: 1013-1015
10.1246/bcsj.20140137
Chem. Commun.
巻: 50 ページ: 15195-15198
10.1039/c4cc06780k.
Sci. Rep.
巻: 4 ページ: 6767
10.1038/srep06767.
Biosensors and Bioelectronics
巻: 42 ページ: 36-40
10.1016/j.bios.2012.10.042.
J. Mol. Diagn.
巻: 15 ページ: 227-233
10.1016/j.jmoldx.2012.10.004.
巻: 49 ページ: 6355-6458
10.1039/c3cc41801d.
巻: 23 ページ: 3539-3541
10.1016/j.bmcl.2013.04.037.
巻: 49 ページ: 5501-5503
10.1039/c3cc42221f.
Angew. Chem. Int. Ed.
巻: 52 ページ: 9976-9979
10.1002/anie.201303370.
Bioorg. Med. Chem.
巻: 21 ページ: 7101-7106
10.1016/j.bmc.2013.09.007.
巻: 49 ページ: 282-289
10.1016/j.bios.2013.05.022.
Appl. Phys. Lett.
巻: 103 ページ: 023112
