| 研究課題/領域番号 |
23246142
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| 研究機関 | 東京農工大学 |
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研究代表者 |
松岡 英明 東京農工大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (10143653)
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| 研究分担者 |
斉藤 美佳子 東京農工大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (20291346)
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| 研究期間 (年度) |
2011-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | 胚性幹細胞 / 未分化状態 / 遺伝子発現動的制御 / フェムトインジェクション |
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| 研究概要 |
（１）ES細胞内の標的遺伝子として選択した４遺伝子の内、Oct3/4, Sox2の遺伝子産物であるタンパク質を合成した。Oct3/4タンパク質はOct3/4自身の転写因子の一つでもあるため、Oct3/4プロモーター活性に対する効果を調べた。すなわち元々Oct3/4を発現していない細胞株MIN6にOct3/4プロモーター活性可視化ベクター(pP-Oct3/4-EGFP)と共にOct3/4タンパク質をフェムトインジェクションで同時導入したところ蛍光が観察された。一方、元々Oct3/4を十分発現しているES細胞に導入した場合は、予想に反して蛍光強度が低下した。これは転写因子結合サイトを共有する他の因子、例えばSox2タンパク質の結合を、高濃度のOct3/4タンパク質が阻害した結果、全体でのOct3/4発現活性が低下したのではないかと推定した。Sox2タンパク質に関しては、合成タンパク質を精製し、結合サイトを有するDNAフラグメントとの結合活性をゲルシフトアッセイで確認し、細胞内での転写活性を調べる準備が整った。Nanog、及びCdx2に関してはタンパク質合成には至っていない。
（２）4種の遺伝子の発現増強ベクター、4種の遺伝子の発現抑制ベクター、4種の遺伝子のプロモーター活性可視化ベクター、を前年度より継続して作製した。
（３）4種の標的遺伝子のプロモーター活性を可視化した細胞株、4種の標的遺伝子の発現に伴って標的タンパクと可視化タンパクが同時に生成する細胞株を作製した。前者に関してはCre-loxP相同組換えにより作製したところOct3/4、Sox2、Nanogについては作製できたが、Cdx2については作製には至らなかった。
（４）遺伝子発現レベルを制御するベクター、因子、タンパク質などのメニューを揃え、フェムトインジクションを利用した動的解析の準備を8割程度整えた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
（1）4種の標的遺伝子に関する発現増強ベクター、発現抑制ベクター、プロモーター活性可視化ベクターはその設計方法は同じでも遺伝子によって成功するものとそうでないものがあった。具体的には、プロモーター活性可視化ベクターをCre-loxP相同組換えによって、共通の細胞株であるEBRTcH3のROSA座に挿入しようとしたが、Oct3/4、Sox2、Nanogについては成功したが、Cdx2については成功しなかった。その理由は、いまだに不明であるが、こうした予想外の事の検討に時間がかかり予定が遅れた。
（2）合成したOct3/4タンパク質が、ゲルシフトアッセイによって転写因子としての活性を保持していると推定されたので、ES細胞に導入して、そのOct3/4に対する自己発現増強活性を調べたところ、予想に反して発現が低下した。この結果には当惑したが、コントロールとして、元々Oct3/4を発現していないMIN6細胞を使ったところ、予想通りの結果が得られた。こうしたコントロール実験の条件検討などに時間を要して、予定が遅れた。
（3）標的遺伝子タンパク質の合成は今年度も進捗ははかばかしくなかった。精製条件を多少改善したが生成量は少なく、後続の実験に用いるために十分な量を得るための時間が予想以上にかかった。のみならず、Nanog、Cdx2に関しては合成に至らなかった。これに関しては、最終年度における全体計画を見直しする必要がある。
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| 今後の研究の推進方策 |
（1）4種の標的遺伝子に関して①発現増強ベクター、②発現抑制ベクター、③遺伝子産物のタンパク質、④遺伝子発現レベル可視化細胞株、を全て作製することが当初の目標であったが、遺伝子によって作製できるものとできないものがあった。最終年度に向けては、全てを網羅的に作製することよりも、最終的な目標である、複数遺伝子の発現バランスと分化・未分化状態の動的制御の関係について、具体的な解析例を提示すること、それによって外部に発表できる研究成果としてまとめることを最優先すべきであると結論した。
（2）特にタンパク質合成は当初から難航したが、漸く、Oct3/4及びSox2だけは精製品を得るに至った。そのうちOct3/4については細胞内で活性を示すことを示唆する結果が得られたが、試行数は少ない。一方、Sox2に関しては、まだ、細胞内での活性確認をするには至っていない。この2つのタンパク質に集中して、細胞内での活性確認、及びその定量的解析を優先して進めるべきであると結論した。
（3）複数因子を同時導入するためのフェムトインジェクション装置として、２台のロボットがあるが、使い勝手が異なる。そこで、最終年度に向けて、複数の実験者をそれぞれのロボット専任として訓練し、全体としてのインジェクション効率（速度と成功率）を向上させるような体制にすることとした。
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