研究課題
DNA相同鎖検索反応は組換えの根幹をなす反応であり、真核生物ではRecAのホモログRad51が体細胞分裂期の組換えに機能する一方、減数分裂期組換えにはRad51に加え、減数分裂期特異的RecAホモログDmc1が働く。Rad51, Dmc1ともにDNA上のフィラメント構造は類似していて、その特異性は一緒に働く正，負の因子群の働きにより決まる。本研究は、Rad51, Dmc1によるDNA鎖相同検索反応の分子基盤を理解するために、Rad51集合を助ける新規因子、Psy3-Csm2-Shu1-Shu2複合体の構造学解析に基づく分子論的機能解析、Dmc1の集合を担うMei5-Sae3複合体の構造解析に加え、統括的に体細胞、減数分裂期の組換えの特性を分子レベルで理解することを目的とする。本年度はPsy3-Csm2-Shu1-Shu2複合体, Psy3-Csm2, Shu1-Shu2のサブ複合体を精製して、その生化学的性質を同定した。その結果、Psy3-Csm2 二量体であるサブ複合体にDNA結合能があることが分かった。現在、Psy3-Csm2-Shu1-Shu2 ４量体、,コア要素であるPsy3-Csm2複合体のX線構造解析に取り組んでいる。遺伝的な解析を用いて、この複合体がRad51のフィラメント形成を促進することが示されているが、クロマチン免疫沈降法により、Rad52, Rad55-57とは独立して染色体に結合することでRad51のフィラメント形成を促すことが示唆された。一方、Dmc1のメデエイターであるMei5の結合する因子として、この因子にFlagタグを導入した株を作成し、その親和性精製により、Mei5と結合するタンパク質を同定する系を作り上げた。複数種類のタンパク質が同定出来、Mei5と複合体を形成するSae3やDmc1が存在することも確認している。また、Mei5-Sae3は結晶化にも成功している
2: おおむね順調に進展している
組換え反応に中心的な役割を果たすRad51の集合を促す新規のタンパク質複合体、Psy3-Csm2-Shu1-Shu2四量体を同定した。この複合体のコアであるPsy3-Csm2がDNA結合活性を持つことを見つけた。さらに、Psy3-Csm2二量体のX線構造解析を目指し、その結晶化に着手している。同時にDmc1の集合を促すことが知られているMei5-Sae3の構造解析のもとになる結晶化にも取り組んでいる一方、Mei5と相互作用する新奇の因子を同定できる系を開発した。今後に大きな展開ができる。特に、タンパク質複合体の構造的視点から２つのRecAホモログ、Rad51, Dmc1の減数分裂期の組換えの機能分担に関する情報が得ることが期待でき、今後の大きな進展が期待できる。
Rad51の集合を促すPsy3-Csm2-Shu1-Shu2(PCSS)四量体のコアであるPsy3-Csm2がDNA結合活性を持つことを見つけた。さらに、Psy3-Csm2二量体のX線構造解析に必要な結晶化にに取り組み、予備的ではあるが結晶を得ることが出来る可能性が高く、その結晶を用いて、最終的なX線構造を決定する。その構造に基づき、DNA結合活性やRad51の集合に必要な領域についての詳細な変異解析を行うことで、この複合体のRad51集合を促進するメカニズムに迫る。同時に、Rad51, PCSS複合体を用いて試験管内の組換え反応系の確立が急務である。また、PCSS複合体はDNA複製フォークの修復にも関わることが知られているので、その機能を生化学的にも明らかにすることもきな将来の目標となる。一方、Dmc1の集合を促すことが知られているMei5-Sae3の構造解析については、結晶化に取り組む一方、相互作用する複数の候補タンパク質を同定出来るところまで進んでいて、今後は質量分析を用いて、同定する予定である。同定された因子については、遺伝的な解析を行うことで、Dmc1やMei5-Sae3複合体との機能的な連携について詳細に解析する予定である。。
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http://www.protein.osaka-u.ac.jp/genome/Shinohara-HP-index.html
