研究課題
細胞は必須金属イオンを過不足なく濃度調節しつつ、タンパク質の構成要素として利用している。過不足のない濃度調節について、液胞が担う金属イオンの集積機能とそれを支えるプロトンポンプに焦点を当ててきた。分子素子自身の構造と機能に加え、システム全体としてのイオン調節機構の両面を解明することを研究目的とした。本研究では、液胞への金属集積を担うZn2+/H+対向輸送体（MTP1）とその機能を支えるH+-ピロホスファターゼ（H+-PPase）に焦点を当てている。MTP1のような二次能動輸送体は液胞膜プロトンポンプ（V-ATPaseとH+-PPase）が形成するpH勾配を駆動力する。各分子の詳細な作動機構、イオン濃度センサーを含む機能ドメイン、生理機能の特性等の解明を目的とした。さらに、金属イオンホメオスタシスに関わると推定される新規金属結合タンパク質（PCaP）についても焦点を当てた。今年度は、MTP1についてイオン選択性とイオン輸送活性に機能する特定アミノ酸残基を、亜鉛結合領域、イオン選択領域等として特定し、さらに活性調節上きわめて重要と推定しているHisを多く含む領域（His領域）のタンパク質化学的な解析を進めて亜鉛結合数、亜鉛結合による微細な構造変化、亜鉛に対する結合定数を、ITCあるいはCDスペクトル解析で明らかにし、２編の論文として公表した。また、MTP1遺伝子を欠いた変異株（亜鉛感受性株）にMTP1遺伝子を導入すれば亜鉛耐性が回復し、高速郵送型のMTP1改変分子を発現した植物体では亜鉛欠乏により感受性となることなどを明らかにした。また、H+-PPaseとMTP1が根端領域で協調的に高いレベルで発現することを明らかにできた。金属結合タンパク質については、タンパク質化学的特性、および細胞生物学的機能の一部を明らかにした。
1: 当初の計画以上に進展している
液胞膜亜鉛輸送体MTP1は、植物の過剰亜鉛に対する耐性を規定する不可欠な膜輸送体である。そのMTP1がどのように亜鉛濃度を感知し、過剰分を液胞に能動輸送するのかを主要課題とした。部位特異的変異導入法で機能アミノ酸残基、たとえばイオン選択性や輸送活性に関わる残基、を特定することができ、論文発表した。さらに、シロイヌナズナに特徴的なHis領域のタンパク質化学的な性質を解明し論文投稿まで辿り着くことができた。また、亜鉛輸送体およびその変位酵素の発現植物の作成と生理的な特性を見出しつつある。プロトンポンプの可視化と観察においても具体的に進展し、世界のスタンダードとなる可視化液胞マーカーの作出に成功した。全体として当初の予定をやや上回った成果である。
(1) H+-PPaseの構造と機能調節機構：植物から精製した分子の結晶解析から膜ドメイン部分の構造情報が得られる。予測される機能部位のアミノ酸を部位特異的に変異させた酵素を作成して機能を判定する。(2) H+-PPaseの可視化と細胞特異性、金属応答性の解明：自プロモータ::H+-PPase-GFPを発現させた株を作成できたので、金属の過不足条件での組織・細胞でのH+-PPaseの発現強弱、液胞形態を解析する。(3) Zn輸送体の亜鉛濃度センサー機能の解明：His領域は細胞質Zn2+濃度のセンサーと推定される。His領域のタンパク質化学的特性の一部は解明できたので、次のステップとしてNMR法により高次構造の解明につなげ、構造をもとに調節機能を議論する。(4) 液胞プロトンポンプと金属輸送体変異株での金属応答性の解明：H+-PPaseとV-ATPaseの機能欠失株が金属（Zn, Cuなど）の過不足条件でどのような表現型を示すかを解析し、金属ホメオスタシスにおけるプロトンポンプの寄与を判定する。
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