研究課題
本研究は､Ｔﾘﾝﾊﾟ球のﾚﾊﾟﾄｱ形成を担う胸腺微小環境の分子本態解明に向けて､(1) 皮質と髄質それぞれの胸腺上皮細胞に発現される自己ﾍﾟﾌﾟﾁﾄﾞの同定､(2) 胸腺上皮細胞の亜集団の同定と分化系譜分岐機構の解析､(3) ﾏｳｽ胸腺上皮細胞の解析成果の応用によるﾋﾄ胸腺上皮細胞解析技術の開発を目指している｡この目的で本年度は､まず(1) Cyclin D1 強制発現による巨大胸腺ﾏｳｽを用いることで胸腺上皮細胞に発現されるMHC会合ﾍﾟﾌﾟﾁﾄﾞ解析を行いつつ､β5t 陽性と陰性の細胞株を用いて皮質上皮細胞でβ5t 依存的に発現されるMHC会合自己ﾍﾟﾌﾟﾁﾄﾞのﾓﾁｰﾌ解析を進めた｡その結果ようやく､自己ﾍﾟﾌﾟﾁﾄﾞのｱﾐﾉ酸配列ﾓﾁｰﾌが得られるようになってきた｡そこで､それらのﾓﾁｰﾌがどのようにＴ細胞の正の選択誘導に関与するのか､TCRﾄﾗﾝｽｼﾞｪﾆｯｸＴ細胞分化のﾓﾃﾞﾙ系を用いて構造機能相関解析を開始した｡(2) 胸腺髄質上皮細胞の増殖と分化にRANKL, CD40, LTβRといったｻｲﾄｶｲﾝ受容体ｼｸﾞﾅﾙが関与することを示してきた実績を基盤に関連ｼｸﾞﾅﾙ伝達分子の関与について解析した｡その結果、非古典的NKκBｼｸﾞﾅﾙ経路を阻害するTRAF3は髄質上皮細胞の増殖と分化を制御するｼｸﾞﾅﾙ伝達に中心的な役割を果たすことを明らかにした｡また､髄質上皮細胞に発現されるCD80/86と胸腺細胞に発現されるCD28のあいだでの相互作用が髄質上皮細胞の増殖と分化の制御に重要であることを明らかにした｡更に､(3) ﾋﾄ胸腺の機能について､新生児期の心臓血管手術に際して視野確保の目的で胸腺を摘出する際には後年の免疫機能保持のために全摘出ではなく部分摘出のほうがよいことを示すとともに､これまで開発を進めてきたヒト胸腺上皮細胞解析技術を用いることで､胸腺の過形成を伴う重症筋無力症患者の胸腺ではﾊｯｻﾙ小体の増加やCCL21の発現上昇など髄質上皮細胞の性状に特徴があることを見出し､重症筋無力症の一因に胸腺髄質上皮細胞の分化や維持が関与する可能性を示唆した｡
2: おおむね順調に進展している
期間全体の具体的目標のうち、（１）皮質と髄質それぞれの胸腺上皮細胞に発現される自己ペプチドの同定については、巨大な胸腺を有するK5D1tg マウスを用いるとともに、上皮細胞粗精製法を改良することによって、順調に解析を推進している。TCRトランスジェニックＴ細胞分化のモデル系を用いて構造機能相関解析を進めていくことで、正と負の選択シグナルを惹起する自己ペプチドMHC複合体の構造原理同定に至ることが考えられる。また、（２）胸腺上皮細胞の亜集団の同定と分化系譜分岐機構の解析については、髄質上皮細胞の増殖と分化を制御する新たな分子経路を２種類（TRAF3とCD28-CD80/86）同定することができた。更に、（３）ヒト胸腺上皮細胞の解析に関しては、新生児期の心臓血管手術に際しての胸腺摘出においては部分摘出にメリットがあることを提示することができたとともに、重症筋無力症の一因に胸腺髄質上皮細胞の分化や維持が関与する可能性を示唆することができた。このように、いずれの具体的目標においても、研究は順調に進展し成果が挙がっている。
昨年度までの成果を基に、当初計画の３点についてそれぞれ次のように更なる研究を推進し、本研究課題の最終年度として成果発表を行う。（１）胸腺上皮細胞に発現される自己ペプチドの同定：Cyclin D1 強制発現による巨大胸腺マウスとβ5t あるいはAire の欠損マウスの交配、MHC会合ペプチドのコンピュタ予測、β5t強制発現細胞株の解析等を組み合わせて活用することにより、皮質上皮細胞および髄質上皮細胞に発現されるMHC 会合「自己ペプチド」レパトアの直接的同定を進める。得られつつある自己ペプチドのアミノ酸配列モチーフがどのようにＴ細胞を選択するのか、TCRトランスジェニックＴ細胞分化のモデル系を用いて構造機能相関解析を進めることで、正と負の選択シグナルを惹起する自己ペプチドMHC複合体の構造原理同定に至ることを目指す。（２）胸腺上皮細胞亜集団の同定と分化系譜分岐機構の解析： β5t, Aire, CCL21 の発現を指標にすることで、皮質上皮細胞と髄質上皮細胞およびそれらの亜集団がどのように共通前駆細胞から分岐分化するのか細胞系譜形成機構を解析するため、これらの遺伝子発現を直接的にまたはCre/loxPさらにはrtTA/tetOを介して、蛍光タンパク質の発現によってモニターするレポーターマウスを作製している。これらのマウスにおける細胞の蛍光発現解析を進めることで、皮質上皮細胞と髄質上皮細胞それぞれの機能的亜集団の同定と分化系譜分岐機構を明らかにする。（３）ヒト胸腺上皮細胞解析技術の開発：マウス胸腺由来の皮質上皮細胞と髄質上皮細胞を対象にした分子発現解析を更に進めることで、ヒト胸腺上皮細胞解析の基盤技術確立を図り、正常と疾患におけるヒト胸腺機能の解析を開始する。
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