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2013 年度 実績報告書

超高速2光子励起顕微鏡による革新的神経細胞観察法の実践

研究課題

研究課題/領域番号 23300121
研究機関早稲田大学

研究代表者

井上 貴文  早稲田大学, 理工学術院, 教授 (10262081)

研究期間 (年度) 2011-04-01 – 2014-03-31
キーワード神経細胞 / 樹状突起 / スパイン / 2光子励起顕微鏡 / 蛍光相関分光法 / タンパク質 / 拡散
研究概要

本研究は申請者の開発したランダムアクセス型2光子励起顕微鏡システムを用いて、これまで困難だった遊離タンパク質の動態を直接 計測することを目指す。多点で同時に蛍光相関分光法(FCS)を適用することにより樹状突起の細胞質中を高速に移動するタンパク質分 子の動態を捉え、シナプスと核を連絡するシグナル系の実態を明らかにすることを目的とする。これまで細胞質内を拡散する遊離型タンパク質は拡散速度の桁違いの大きさのため直接的な動態の計測は困難だった。蛍光相関分光法(FCS)は溶液中での一分子の振る舞いを計測する手法で、これを細胞内に適用することにより細胞質内の遊離タンパク質の挙動を追跡できる。しかし従来のFCS装置は細胞内の一点からしか記録できず、細胞内の様々な部位における機能タンパク質の動態解析を行うには制約があった。特に神経細胞は細胞内の機能局在性が高く、同時多点からのFCS解析は非常に多くの情報をもたらすことが期待される。本研究では新規に開発した2光子励起顕微鏡システムを用いカルモジュリン、CamKII、Ca結合タンパク質(calbindin等)などシナプス機能に重大な機能分子のスパイン内外での動態を検出することを試みた。昨年度はGFP発現プラスミドあるいはGFP融合CamKIIタンパク質発現プラスミドをマウス由来初代培養神経細胞に発現させ細胞質の複数点から 蛍光強度変化を10kHz以上の時間解像度で取得することに成功し、自己相関関数よりタンパク質の細胞局所での拡散係数が異なることを見いだした。本年度は昨年度に引き続き初代培養神経細胞を用いて樹状突起およびスパイン内のタンパク質のFCS計測を試みた。CamKIIαとCamKIIβはアクチン骨格への親和性の違いによりシナプスでの挙動が異なることが示唆されているが、FCS計測により異なる拡散パターンを示唆する知見が得られた。

現在までの達成度 (区分)
理由

25年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

25年度が最終年度であるため、記入しない。

  • 研究成果

    (2件)

すべて 2014 2013

すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件) 学会発表 (1件)

  • [雑誌論文] Chemically-inducible diffusion trap at cilia (C-IDTc) reveals molecular sieve-like barrier2013

    • 著者名/発表者名
      Yu-Chun Lin, Benjamin Lin, Pawel Niewiadomski, Hideki Nakamura, Siew Cheng Phua, John Jiao, Takafumi Inoue, Andre Levchenko, Rajat Rohatgi, Takanari Inoue
    • 雑誌名

      Nature Chemical Biology

      巻: 49 ページ: 7313-7315

    • DOI

      10.1038/nchembio.1252

    • 査読あり
  • [学会発表] FRAP analysis with boundary value updating is a robust method of diffusion kinetics quantification2014

    • 著者名/発表者名
      Hideki Nakamura, Takafumi Inoue
    • 学会等名
      58th Annual Meeting of Biophysical Society
    • 発表場所
      San Francisco, U.S.A.
    • 年月日
      20140215-20140219

URL: 

公開日: 2015-05-28  

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