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2012 年度 実績報告書

蛍光偏光解消法によるナノスペース粘度計測法の開発

研究課題

研究課題/領域番号 23310071
研究機関東北大学

研究代表者

鈴木 誠  東北大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (60282109)

研究分担者 森本 展行  東北大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (00313263)
和沢 鉄一  東北大学, 工学(系)研究科(研究院), 研究支援者 (80359851)
研究期間 (年度) 2011-04-01 – 2014-03-31
キーワード局所粘度計測 / 蛍光偏光解消 / 回転相関時間 / ハイパーモバイル水が / アクチンフィラメント / 蛍光異方性 / 水和水 / 水和水の粘度
研究概要

ナノシステムの摺動性材料を開発する上で、摺動部材間の間隙を満たす水層の粘度を計測することは重要な課題である。ナノシステム材料としてタンパク質は有望な材料であるが、タンパク質表面に接する限られたナノスペースにある水の粘度を局所的に直接測定しようとする試みはまだない。ここで提案する研究は、タンパク質(ここではアクチン)表面に可変リンカー長の蛍光分子を結合し、パルスレーザーで励起し、蛍光偏光解消を時間分解で測定することにより、蛍光分子の回転相関時間を求め、対象物表面に結合した蛍光分子を取り囲むナノボリュームの水の粘度を測定する方法の確立を目的とする。
研究実施内容:本研究ではタンパク質表面に可変リンカ―長の蛍光分子を結合し、パルスレーザーで励起し、蛍光偏光解消を時間分解測定を行ってきた。これまでの誘電緩和測定によれば、アクチンフィラメント表面にハイパーモバイル水が厚さ1nm程度存在することが予想されるので、アクチンに蛍光色素を結合し、水和層の中から外に至る水の粘度変化を測定することをめざした。具体的には、
・蛍光偏光解消法による回転相関時間測定システムを構築した。
・対象とするタンパク質分子としてアクチンを選び、ハイパーモバイル水が存在すると予想される部位(アクチンCys374等)に蛍光色素を導入した。これまでCy3、rhodamin 6GにシステインのSHに結合するマレイミド基を導入した。そのとき、色素部と反応基間のリンカーをポリエチレングリコ―ルPEGをリンカーとする長さ0.5nm~2nmの蛍光色素を作成した。
・蛍光寿命、蛍光異方性を作成した各色素に対して測定し基本データを得た。
今後、作成した蛍光色素をタンパク質に結合し、タンパク質表面の粘度測定を行っていく。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本研究は、タンパク質(ここではアクチン)表面に可変リンカー長の蛍光分子を結合し、パルスレーザーで励起し、蛍光偏光解消を時間分解で測定することにより、蛍光分子の回転相関時間を求め、対象物表面に結合した蛍光分子を取り囲むナノボリュームの水の粘度を測定する方法の確立を目的としている。これまでの達成度は以下の通り。
・蛍光色素作成の面では、蛍光分子(Cy3、rhodamin 6G)にシステインのSHに結合するマレイミド基を導入し、色素部と反応基間のリンカーをポリエチレングリコ―ルPEGをリンカーとする長さ0.5nm~2nmの蛍光色素を作成することができ、ほぼ計画通り進んでいる。
・蛍光偏光解消法による回転相関時間測定システムを構築した。これらの蛍光色素の回転相関時間を求めるために、蛍光色素の蛍光寿命と、パルスレーザーで励起したときの蛍光偏光解消を時間分解測定を行ってきた。その結果、小さな分子の回転は1nsを切る応答を検出しなければならないため、Cy3系の色素で回転相関時間の評価を行うことができた。
・アクチンのCys374にこれらの蛍光色素を結合し、水和層の中から外に至る水の粘度変化を測定することをめざした。しかしながら、リンカー長が短い場合アクチン表面にトラップされタンパク質分子の回転相関時間に近い値を得た。またリンカー長が中程度の場合、溶媒の粘度に対応する回転相関時間を得たが、さらにリンカー長を長くすると、再びタンパク質表面にトラップされることを示唆する結果を得た。
以上のように、ほぼ計画通り順調に進展しているが、タンパク質表面との相互作用についてはさらに蛍光色素の選定あるいは化学修飾等の工夫をとりいれることが求められている。

今後の研究の推進方策

本研究の3年目は最終年度になるが、次の2つの点で目標に向け研究を進めていく。
・引き続き蛍光色素としてタンパク質(アクチンは中性pHでは負に荷電)との相互作用の少ない負に荷電した色素を用いる。また、リンカーとしてフレキシブルさの異なる分子鎖も検討対象に入れる。
・蛍光偏光解消を測定する上で、パルスレーザーを用いる以外に、CWレーザーを高周波変調することで蛍光色素の回転相関時間を評価する手法を示した研究が報告されたので、本研究でも対応可能な技術であることから、その方法を発展させる取り組みを進めている。これまでにない要素技術を開発しつつあり、小さな蛍光分子の回転相関時間計測にも対応できる見通しがでてきた。この方法を展開していく予定である。

  • 研究成果

    (11件)

すべて 2013 2012 その他

すべて 雑誌論文 (3件) (うち査読あり 3件) 学会発表 (7件) (うち招待講演 4件) 備考 (1件)

  • [雑誌論文] Hydration state change of horse heart cytochrome c corresponding to trifluoroacetic-acid-induced unfolding,, and Makoto Suzuki2013

    • 著者名/発表者名
      Yusuke Miyashita, Tetsuichi Wazawa, George Mogami, Satoshi Takahashi, Yoshihiro Sambongi, and Makoto Suzuki
    • 雑誌名

      Biophysical Journal

      巻: 104 ページ: 163/172

    • DOI

      10.1016/j.bpj.2012.11.3825

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Molecular Dynamics Study of Fast Dielectric Relaxation of Water2012

    • 著者名/発表者名
      Yoji Kubota, Akira Yoshimori, Nobuyuki Matubayasi, Makoto Suzuki, and Ryo Akiyama
    • 雑誌名

      J. Chem. Phys.

      巻: 137 ページ: 224502(1-4)

    • DOI

      10.1063/1.4769972

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Role of Water in Actin–Myosin Binding and Actin Polymerization: Rotational and Translational Mobility of Water Molecules2012

    • 著者名/発表者名
      Makoto Suzuki, Tetsuichi Wazawa, George Mogami, and Takao Kodama
    • 雑誌名

      J. Phys. Soc. Jpn.

      巻: 81 ページ: SA003(1-14)

    • 査読あり
  • [学会発表] Hydration and ATP energetic on Actomyosin2013

    • 著者名/発表者名
      鈴木 誠
    • 学会等名
      Alpbach Workshop on Molecular Motors 2013
    • 発表場所
      Alpbach, Austria
    • 年月日
      20130316-20130322
  • [学会発表] Effects of halide ions on the hydration properties of F-actin, Effects of nucleotide and cosolvents on the hydration state of myosin subfragment-12013

    • 著者名/発表者名
      鈴木 誠
    • 学会等名
      新学術領域研究「水を主役としたATPエネルギー変換」国際シンポジウム
    • 発表場所
      仙台秋保 岩沼屋
    • 年月日
      20130306-20130308
    • 招待講演
  • [学会発表] Hypermobile water observed in sulfonates, phosphates solutions and its volume change in protein interactions2013

    • 著者名/発表者名
      鈴木 誠
    • 学会等名
      新学術領域研究「水を主役としたATPエネルギー変換」国際シンポジウム
    • 発表場所
      仙台秋保 岩沼屋
    • 年月日
      20130306-20130308
    • 招待講演
  • [学会発表] Anion-dependence of hypermobile water in Na-, K-halide solutions at low concentrations measured by high-resolution microwave dielectric spectroscopy2013

    • 著者名/発表者名
      鈴木 誠
    • 学会等名
      新学術領域研究「水を主役としたATPエネルギー変換」国際シンポジウム
    • 発表場所
      仙台秋保 岩沼屋
    • 年月日
      20130306-20130308
    • 招待講演
  • [学会発表] マイクロ波誘電緩和分光法による有機・無機イオンおよびタンパク質の水和特性

    • 著者名/発表者名
      鈴木 誠
    • 学会等名
      日本分光学会テラヘルツ分光部会シンポジウム「テラヘルツ分光法の最先端VI~ここまできたテラヘルツ時間領域分光~」
    • 発表場所
      筑波
    • 招待講演
  • [学会発表] 時間分解蛍光偏光法によるタンパク質周囲の水和層の局所粘度変性測定

    • 著者名/発表者名
      Tetsuichi Wazawa, George Mogami, Nobuyuki Morimoto, NOriyoshi Ishida, Makoto Suzuki
    • 学会等名
      第50回日本生物物理学会年会
    • 発表場所
      名古屋大学
  • [学会発表] 誘電緩和分光法によるアルキルカルボン酸の水和特性

    • 著者名/発表者名
      Yangtian Wang, Goerge Mogami, Tetsuichi Wazawa, Nobuyuki Morimoto, Makoto Suzuki
    • 学会等名
      第50回日本生物物理学会年会
    • 発表場所
      名古屋大学
  • [備考] 水を主役としたATPエネルギー変換

    • URL

      www.material.tohoku.ac.jp/atpwater/

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公開日: 2014-07-24  

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