研究課題
本年度は、配糖体型生理活性物質の標的同定に必須の機能性プローブ分子の合成を行い、標的精製を進めた。これらを用いることで、植膜上に局在する標的タンパク質とこれとは等電点の大きく異なる可溶性タンパク質（未同定）との複合体形成を促進することで機能を発現することを明らかにすることが出来た。また、強心性ステロイド配糖体とそのアグリコンが、それぞれ異なる標的タンパク質に作用することが明らかになった。強心性ステロイド配糖体およびそのアグリコンを結合させたアフィニティー担体、および培養細胞系を用いるレポーターアッセイ系の使用によって、アグリコンの標的候補分子を発見した。親化合物が細胞膜上の酵素を標的とするのに対して、アグリコンの標的分子は全く異なることが明らかになった。これらの結果は、申請者の提唱する"Glycosylation Switching"が、生物界に広くみられることを示すと共に、その分子的実体解明に繋がる重要な成果である。また、"Glycosylation Switching"は、ひとつの生理活性分子が複数の活性を持つ場合にその配糖体化が極めて重要な調節機構として機能することを示しており、未知の生理活性制御機構としてその解明が強く望まれる。
1: 当初の計画以上に進展している
本年度は懸案事項であった、標的タンパク質のアフィニティー精製に成功した。これによって、標的同定に必要なバリデーション実験へと研究を進めることが出来る。また、ジャスモン酸とその配糖体が別々の生理活性と受容体を有することを、物質レベルで実証することが出来るため、申請者の提唱する"Glycosylation Switching"の分子的実体解明に繋がる。また、これらの成果をヒトに展開するために、ステロイド配糖体の研究を開始したが、これに関しても受容体解明の一里塚を越えた状態であり、のこりの年限において、ヒトにおける"Glycosylation Switching"の分子的実体解明に繋がる成果を上げることが出来ると期待している。
昨年度までの研究において、配糖体型生理活性物質を中心とする"Glycosylation Switching"の分子的実体解明のために必要な標的分子同定研究に大きな進展が見られた。すなわち、植物ホルモン配糖体分子は、膜上に局在する標的タンパク質とこれとは等電点の大きく異なる可溶性タンパク質（未同定）との複合体形成を促進することで機能を発現し、また強心性ステロイド配糖体とそのアグリコンが、それぞれ異なる標的タンパク質に作用することが明らかになった。最終年度となる本年度は、未同定の植物ホルモン配糖体可溶性標的タンパク質の精製と同定を進めると共に、標的のバリデーションに研究の中心をおいていきたい。バリデーションは、前者に関してはアフリカツメガエル卵母細胞系を用いたボルテージクランプ、後者に関してはノックダウン実験系の確立による。すでに予備的実験は終了しているが、機能を持ったタンパク質の発現など、実験的な困難もあり得るので、必要に応じて他の実験系の開発も行う予定である。また、おのおのの標的のリコンビナントタンパク質を発現させることで、詳細な結合データなどを取得することも必須である。これらの実験を通じて、"Glycosylation Switching"の分子的実体となる、各標的タンパク質の同定を完了したい。
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