組織ペプチドーム解析を可能とする技術開発と新規生理活性ペプチドの探索・同定

2013 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 23310155
• 研究機関: 独立行政法人国立循環器病研究センター
• 研究代表者: 南野 直人 独立行政法人国立循環器病研究センター, 研究所, 部長 (50124839)
• 研究分担者: 望月 明和 独立行政法人国立循環器病研究センター, 研究所, 研究員 (30589601) ; 佐々木 一樹 独立行政法人国立循環器病研究センター, 研究所, 室長 (80260313)
• 研究期間 (年度): 2011-04-01 – 2014-03-31
• キーワード: ペプチドーム解析 / 生理活性ペプチド / 内在ペプチド / 分解ペプチド / 分解ペプチド標識法 / 質量分析 / プロセシング

研究概要

組織ペプチドームを解析できれば、生理活性ペプチド等の探索の有効な情報源となるが、タンパク質の分解ペプチドと内在ペプチドとが識別できず、研究の進展を阻害している。本研究では、内在／分解ペプチドの識別法を作成し、組織ペプチドーム解析を実施可能とする。
先ず、標識試薬の脱離は後処理に必要な酸性条件で起こるが、脱離速度は遅く、時間や保存条件を管理すれば軽微で、調製・保管後に解析可能なことを確認した。一方、標識条件の設定は困難で、標識試薬存在下で組織をホモジナイズすると、標識された分解ペプチドが多数生成するが、種々の微小組織サイズで標識試薬溶液へ長時間浸漬しても、十分に標識されなかった。標識試薬の細胞内移行は容易と推定されるが、細胞取込型染色剤で均一に染色される灌流条件でも標識率は低かった。しかし、一部ではあるが70%以上標識された分解ペプチドも検出されたため、細胞内構造が保持された条件では消化・分解は起こりにくく標識率が低いと仮定し、ペプチド解析実験を開始した。
標識試薬溶液で浸漬した下垂体中葉、あるいは灌流した視床下部を詳細解析した結果、明確な標識ペプチド（標識率20％以上）は数％に過ぎないが、前者ではプロセシング以外の切断、後者では細胞内タンパク質の切断による標識率が高く、標識体は分解ペプチドと推定された。以上より、低率でも標識されれば分解ペプチドと判定するのが妥当と推定された。その為、分解ペプチドの検出には、標識に由来する一定質量差を持つ全ピーク対を同位体ピーク群毎に比較し、低標識率でも定量比較可能なシステムの開発が不可欠と考えられた。
並行実施したペプチド抽出法や解析法の改善により、視床下部でも従来より遥かに多くの内在ペプチドを同定できた。特異的切断による生成と推定される新規ペプチドを、少数ではあるが同定した。合成ペプチドを調製し、確立した評価系による活性測定を開始した。

現在までの達成度 (区分)

理由

25年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

25年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] Proteomic analysis of proteins eliminated by low-density lipoprotein apheresis. (2014)
  • 著者名/発表者名: Yuasa Y, Osaki T, Makino H, Iwamoto N, Kishimoto I, Usami M, Minamino N, Harada-Shiba M.
  • 雑誌名: Ther. Apher. Dial. 巻: 18 ページ: 93-102
  • DOI: 10.1111/1744-9987.12056.
  • 査読あり
• [雑誌論文] The effects of super-flux (high performance) dialyzer on plasma glycosylated pro-B-type natriuretic peptide (proBNP) and glycosylated N-Terminal proBNP in end-stage renal disease patients on dialysis. (2014)
  • 著者名/発表者名: Nakagawa Y, Nishikimi T, Kuwahara K, Yasuno S, Kinoshita H, Kuwabara Y, Nakao K, Minami T, Yamada C, Ueshima K, Ikeda Y, Okamoto H, Horii K, Nagata K, Kangawa K, Minamino N, Nakao K.
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 25 ページ: e92314
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0092314.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Global metabolomic analysis of heart tissue in a hamster model for dilated cardiomyopathy. (2013)
  • 著者名/発表者名: Maekawa K, Hirayama A, Iwata Y, Tajima Y, Nishimaki-Mogami T, Sugawara S, Ueno N, Abe H, Ishikawa M, Murayama M, Matsuzawa Y, Nakanishi H, Ikeda K, Arita M, Taguchi R, Minamino N, Wakabayashi S, Soga T, Saito Y.
  • 雑誌名: J. Mol. Cell. Cardiol. 巻: 59 ページ: 76-85
  • DOI: 10.1016/j.yjmcc.2013.02.008.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Continuous stress promotes expression of VGF in melanotroph via suppression of dopamine. (2013)
  • 著者名/発表者名: Tokizane K, Konishi H, Yasui M, Ogawa T, Sasaki K, Minamino N, Kiyama H.
  • 雑誌名: Mol. Cell. Endocrinol. 巻: 372 ページ: 49-56
  • DOI: 10.1016/j.mce.2013.03.012.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Hexarelin treatment in male ghrelin knockout mice after myocardial infarction. (2013)
  • 著者名/発表者名: Mao Y, Tokudome T, Kishimoto I, Otani K, Hosoda H, Nagai C, Minamino N, Miyazato M, Kangawa K.
  • 雑誌名: Endocrinology 巻: 154 ページ: 3847-3854
  • DOI: 10.1210/en.2013-1291.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Complexity of molecular forms of B-type natriuretic peptide in heart failure. (2013)
  • 著者名/発表者名: Nishikimi T, Kuwahara K, Nakagawa Y, Kangawa K, Minamino N, Nakao K.
  • 雑誌名: Heart 巻: 99 ページ: 677-679
  • DOI: 10.1136/heartjnl-2012-302929.
  • 査読あり
• [学会発表] 生理活性ペプチド探索法とペプチドーム解析 (2013)
  • 著者名/発表者名: 南野直人
  • 学会等名: 第17回日本心血管内分泌代謝学会学術総会シンポジウム「治療標的となる心血管ホルモン・タンパク質の発見」
  • 発表場所: 大阪、千里ライフサイエンスセンター
  • 年月日: 20131122-20131123
  • 招待講演
• [学会発表] BNPの測定意義とナトリウム利尿ペプチドの測定意義 (2013)
  • 著者名/発表者名: 南野直人
  • 学会等名: 第17回日本心血管内分泌代謝学会学術総会イブニングセミナー「BNPの臨床応用の現状と最新知見」
  • 発表場所: 大阪、千里ライフサイエンスセンター
  • 年月日: 20131122-20131123
  • 招待講演
• [学会発表] オミックス解析技術を用いた新規血管作動性ペプチド、タンパク質の探索 (2013)
  • 著者名/発表者名: 南野直人、尾崎司、八木寛陽、錦織充広、高山健太郎、佐々木一樹
  • 学会等名: 第36回日本高血圧学術総会シンポジウム「血管作動性物質研究の最前線」
  • 発表場所: 大阪、大阪国際会議場
  • 年月日: 20131024-20131026
  • 招待講演
• [学会発表] Proteomic analysis of left ventricular tissues in dilated cardiomyopathy mouse models (2013)
  • 著者名/発表者名: Nishigori M, Yagi H, Mochizuki A, Sasaki K, Iwata Y, Wakabayashi S, Minamino N.
  • 学会等名: 12th HUPO World Congress
  • 発表場所: 横浜、パシフィコ横浜
  • 年月日: 20130914-20130918
• [学会発表] Peptidomics for naturally occurring secretory peptides using electron transfer dissociation (ETD) mass spectrometry (2013)
  • 著者名/発表者名: Sasaki K, Osaki T, Minamino N.
  • 学会等名: 12th HUPO World Congress
  • 発表場所: 横浜、パシフィコ横浜
  • 年月日: 20130914-20130918
• [学会発表] プロテオームなどのビッグデータの解釈と創薬医療への活用
  • 著者名/発表者名: 南野直人
  • 学会等名: 京都バイオ計測センターシンポジウム「生命のビッグテータの解釈とその社会への展開」
  • 発表場所: 京都、京都リサーチパーク
  • 招待講演
• [図書] Handbook of the Biologically Active Peptides, Second Edition (2013)
  • 著者名/発表者名: Minamino N, Nishikimi T.
  • 総ページ数: 8
  • 出版者: Academic Press/Elsevier
• [図書] Handbook of the Biologically Active Peptides, Second Edition (2013)
  • 著者名/発表者名: Sasaki K, Minamino N.
  • 総ページ数: 8
  • 出版者: Academic Press/Elsevier
• [備考] ペプチドーム解析に基づいた生理活性ペプチドの探索
  • URL: http://www.ncvc.go.jp/res/divisions/pharmacology/001/index.html#-a
• [備考] ペプチドーム解析に基づいた生理活性ペプチドの探索の詳細
  • URL: http://www.ncvc.go.jp/res/divisions/pharmacology/001/a-detail.html