| 研究概要 |
【１】新規RNAi因子の機能解析
遺伝学的なスクリーニングによって単離した２つの新規RNAi因子であるErs1, Dsh1について、酵母ツーハイブリッド法によって相互作用する因子を探索し、Dsh1と相互作用する因子としてRNAポリメラーゼIIの転写終結因子として知られているSeb1/Nrd1を同定した。この知見をさらに検証するため、酵母内でタグ付きのDsh1とSeb1を発現させ結合できるか調べたが、両者の強い相互作用を再現する事は出来なかった。また、Dsh1と結合する領域と推測されたSeb1のC末端側の領域に、ランダムに変異を導入して温度感受性変異株を単離してヘテロクロマチンとの関連を調べた。その結果、温度感受性変異株とサイレンシングの解除に強い相関は確認できなかった。以上の結果より、RNAポリメラーゼIIの終結因子であるSeb1がRNAi経路に関与する可能性は考えられるものの、ヘテロクロマチン構造形成への直接的な寄与は少ないことが示唆された。
【２】CLRC複合体の機能とRNAi
ヒストンメチル化酵素であるClr4は、Rik1、Cul4とともにCLRC複合体を形成している。Cul4はユビキチンリガーゼ活性を有しているがその基質は未だ同定されていない。これまでの網羅的なスクリーニングによって、ユビキチン化される基質としてRNAポリメラーゼIIのサブユニットを含む複数のクロマチン因子を同定している。この知見をさらに検証するため、今年度はin vitroのユビキチン化反応系の開発を進めた。TAPタグを付加したRik1を酵母内で発現させ、アフィニティー精製法によってCLRC複合体を精製することができた。実際に精製CLRCをE1、E2と反応させる事で、in vitroのユビキチン化反応系の構築に成功した。
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