Ｖ１―ＡＴＰａｓｅモーターにおけるＡＴＰ加水分解機構の立体構造基盤

2013 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 23370047
• 研究機関: 千葉大学
• 研究代表者: 村田 武士 千葉大学, 理学(系)研究科(研究院), 准教授 (80415322)
• 研究分担者: 山登 一郎 東京理科大学, 基礎工学部, 教授 (70111458)
• 研究期間 (年度): 2011-04-01 – 2014-03-31
• キーワード: 分子モーター / 酵素反応 / V-ATPase / X線結晶構造解析

研究概要

がんや骨粗鬆症の創薬ターゲットであるV型ATPaseはATP合成酵素（F-ATPase）と類似した構造をもつナノ分子モーター／プロトンポンプである。本研究ではヌクレオチド結合型及び反応中間体のV1-ATPaseのX線結晶構造解析や重要残基変異体の構造機能解析を行い、V型ATPaseのATP加水分解反応に伴った回転分子機構の解明を目的とする。
当初研究計画に従って、下記の研究結果を得た。
ヌクレオチド結合型V1-ATPaseのX線結晶構造解析---前年度の研究により、AMP-PNPが結合したV1-ATPaseのX線結晶構造解析を決定し、ヌクレオチド非結合型V1-ATPaseの構造と比較することにより、ATPの加水分解のメカニズムモデルを作成した。本年度はリン酸をソーキング法により導入し、リン酸がtight型に１分子結合したV1-ATPaseの結晶構造を得ることに成功した。ATP加水分解／合成の反応中間体構造に相当すると考えられた。
ヌクレオチド結合部位の変異V1-ATPaseの機能構造解析---前年度の研究により、ヌクレオチド結合に重要と考えられる残基に関して、部位特異的変異体を３種類作成し、その性質を明らかにした。本年度は、新たな変異体を作成し、前年度同様にATPase活性への影響や、複合体の安定性等を調べ、その成果を論文にまとめた（SpringerPlus in press）。
DG複合体結合部位の変異V1-ATPaseの機能構造解析---前年度の研究により、DG複合体とA3B3複合体の接触面に位置し、回転反応に重要と考えられる残基に関して、部位特異的変異体を３種類作成し、その性質を明らかにした。本年度は、新たな変異体を作成し、前年度同様にATPase活性への影響や、複合体の安定性等を調べ、その成果を論文にまとめた（PLoS ONE, 2013）。

現在までの達成度 (区分)

理由

25年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

25年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] Loose Binding of the DF Axis with the A3B3 Complex Stimulates the Initial Activity of Enterococcus hirae V1-ATPase (2013)
  • 著者名/発表者名: Md. Jahangir Alam, Satoshi Arai, Shinya Saijo, Kano Suzuki, Kenji Mizutani, Yoshiko Ishizuka-Katsura, Noboru Ohsawa, Takaho Terada, Mikako Shirouzu, Shigeyuki Yokoyama, So Iwata, Yoshimi Kakinuma, Ichiro Yamato and Takeshi Murata
  • 雑誌名: PLoS ONE 巻: 8 ページ: e74291
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0074291.t002
  • 査読あり
• [雑誌論文] Basic properties of rotary dynamics of the molecular motor Enterococcus hirae V1-ATPase (2013)
  • 著者名/発表者名: Yoshihiro Minagawa, Hiroshi Ueno, Mayu Hara, Yoshiko Ishizuka-Katsura, Noboru Ohsawa, Takaho Terada, Mikako Shirouzu, Shigeyuki Yokoyama, Ichiro Yamato, Eiro Muneyuki, Hiroyuki Noji, *Takeshi Murata and *Ryota Iino
  • 雑誌名: J. Biol. Chem. 巻: 288 ページ: 32700-32707
  • DOI: 10.1074/jbc.M113.506329
  • 査読あり
• [雑誌論文] Mutant LV476-7AA of A-subunit of Enterococcus hirae V1-ATPase: High affinity of A3B3 complex to DF axis and low ATPase activity (2013)
  • 著者名/発表者名: Md. Jahangir Alam, Ichiro Yamato, Satoshi Arai, Shinya Saijo, Kenji Mizutani, Yoshiko Ishizuka-Katsura, Noboru Ohsawa, Takaho Terada, Mikako Shirouzu, Shigeyuki Yokoyama, So Iwata, Yoshimi Kakinuma and Takeshi Murata
  • 雑誌名: SpringerPlus 巻: 2 ページ: 689
  • 査読あり
• [学会発表] Rotation mechanism of V-ATPase based on crystal structures (2014)
  • 著者名/発表者名: Takeshi Murata
  • 学会等名: Gordon Research Conference (Protons and Membrane Reactions)
  • 発表場所: Ventura（アメリカ）
  • 年月日: 20140223-20140228
  • 招待講演
• [学会発表] 創薬につながるV-ATPaseの構造と機能 (2013)
  • 著者名/発表者名: 村田 武士
  • 学会等名: 第86回生化学会
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 20130911-20130913
  • 招待講演
• [学会発表] Rotation mechanism of Enterococcus hirae V1-ATPase based on asymmetric crystal structures (2013)
  • 著者名/発表者名: Takeshi Murata
  • 学会等名: Gordon Research Conference in Molecular and Cellular Bioenergetics
  • 発表場所: New Hampshire（アメリカ）
  • 年月日: 20130623-20130628
  • 招待講演
• [学会発表] Rotation mechanism of V1-ATPase based on asymmetric crystal structures (2013)
  • 著者名/発表者名: Takeshi Murata
  • 学会等名: International Conference on Structural Genomics 2013
  • 発表場所: Sapporo
  • 年月日: 2013-07-31
• [図書] Cell-free expression of protein complexes for structural biology (2014)
  • 著者名/発表者名: Takaho Terada, Takeshi Murata, Mikako Shirouzu and Shigeyuki Yokoyama
  • 総ページ数: 151-159
  • 出版者: Methods Mol. Biol.
• [図書] 回転分子モーターの動作原理―F1モーターとV1モーターの違い― (2014)
  • 著者名/発表者名: 村田武士
  • 総ページ数: 079-084
  • 出版者: 生物物理
• [図書] 骨粗しょう症に関与する分子モーターの回転メカニズムと創薬への取組み (2013)
  • 著者名/発表者名: 水谷健二、村田武士
  • 総ページ数: 119-122
  • 出版者: アンチエイジングシリーズ3「骨研究最前線」, NTS
• [図書] 「膜タンパク質」の重要性とその構造が拓く未来 (2013)
  • 著者名/発表者名: 村田武士、野村紀通、小林拓也、岩田想
  • 総ページ数: 1-10
  • 出版者: 膜タンパク質構造研究, 化学同人
• [図書] V-ATPaseの分子メカニズム (2013)
  • 著者名/発表者名: 水谷健二、山本三沙岐、村田武士
  • 総ページ数: 35-43
  • 出版者: 膜タンパク質構造研究, 化学同人