転写においてＲＮＡポリメラーゼが形成する過渡的な複合体の構造機能解析

2014 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 23370048
• 研究機関: 独立行政法人理化学研究所
• 研究代表者: 関根 俊一 独立行政法人理化学研究所, ライフサイエンス技術基盤研究センター, チームリーダー (50321774)
• 研究期間 (年度): 2011-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: 酵素 / RNAポリメラーゼ / 転写 / 転写因子 / 校正 / Ｘ線結晶構造解析 / クロスリンク / 構造機能相関

研究実績の概要

RNAポリメラーゼは、転写の進行にともなって様々な構造状態をとり、他のタンパク質等と様々な複合体を形成する。それらの複合体におけるRNAポリメラーゼの構造状態を調べるために、分子内クロスリンクを用いた検出法（システインペア架橋法）を確立した。高度好熱菌のRNAポリメラーゼの二カ所にシステイン残基を導入し、S-S結合の形成効率をもとに、RNAポリメラーゼが「タイト型」と「ラチェット型」のどちらの構造状態をとっているかを判定できるようにした。これを用いて、代表的な転写複合体におけるRNAポリメラーゼの構造状態を解析したところ、これまで機能のよく分かっていなかった「ラチェット型」コンフォメーションは多くの重要な転写機能に関与していることが示された。このことから、転写の諸機能の制御は、新生RNAや転写因子に依存した、2種類の構造状態の切り替えによって達成されているという普遍的原理が示唆された。
転写伸長中のRNAポリメラーゼ（伸長複合体）は、転写エラーを起こしてミスマッチ塩基を取り込んだときなどに、一時的にDNA上を後退して転写を休止する（後退複合体）。このとき、RNAの3’末端は鋳型DNAからはがれた状態にあるが、RNAポリメラーゼはこの3’末端を切断（校正）することにより転写を再開することができる。さらに、GreA等の転写因子は、後退複合体に結合してRNA切断活性を大幅に促進し、転写の校正に重要な役割を果たしている（Gre因子複合体）。これらの複合体の結晶構造解析を行い、RNAポリメラーゼの後退およびRNA切断の構造基盤を明らかにした。RNAポリメラーゼは、後退複合体では「タイト型」を、Gre因子複合体では「ラチェット型」をとっていることが示され、システインペア架橋法による結果を裏付ける結果となった。以上の成果をまとめ、報文として発表した(Mol. Cell 2015)。

現在までの達成度 (段落)

26年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

26年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] The ratcheted and ratchetable structural States of RNA polymerase underlie multiple transcriptional functions. (2015)
  • 著者名/発表者名: Sekine, S., Murayama, Y., Svetlov, V., Nudler, E., Yokoyama, S.
  • 雑誌名: Mol. Cell 巻: 57 ページ: 408-421
  • DOI: 10.1016/j.molcel.2014.12.014
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Time-resolved Raman and polyacrylamide gel electrophoresis observations of nucleotide incorporation and misincorporation in RNA within a bacterial RNA polymerase crystal. (2015)
  • 著者名/発表者名: Antonopoulos, I.H., Murayama, Y., Warner, B.A., Sekine, S., Yokoyama, S., Carey, P.R.
  • 雑誌名: Biochemistry 巻: 54 ページ: 652-665
  • DOI: 10.1021/bi501166r
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Molecular basis of RNA polymerase promoter specificity switch revealed through studies of Thermus bacteriophage transcription regulator. (2014)
  • 著者名/発表者名: Severinov, K,. Minakhin, L., Sekine, S., Lopatina, A., Yokoyama, S.
  • 雑誌名: Bacteriophage 巻: 4 ページ: e29399
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Development of a hexahistidine-3× FLAG-tandem affinity purification method for endogenous protein complexes in Pichia pastoris. (2014)
  • 著者名/発表者名: Higo, T., Suka, N., Ehara, H., Wakamori, M., Sato, S., Maeda, H., Sekine, S., Umehara, T., Yokoyama, S.
  • 雑誌名: J. Struct. Funct. Genomics 巻: 15 ページ: 191-199
  • DOI: 10.1007/s10969-014-9190-1
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [学会発表] 新生RNAによるRNAポリメラーゼの構造変化と機能との相関 (2014)
  • 著者名/発表者名: 関根俊一
  • 学会等名: 第37回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: パシフィコ横浜
  • 年月日: 2014-11-25 – 2014-11-27
• [備考] 理研ライフサイエンス技術基盤研究センター 超分子構造解析研究チーム
  • URL: http://www.clst.riken.jp/activity/structuralbiology_group1_team2.html
• [備考] 理研プレスリリース 「RNAポリメラーゼの働きを切り替えるメカニズムを解明」
  • URL: http://www.riken.jp/pr/press/2015/20150206_3/