研究課題
本課題は、これまで開発してきたポジティブ・ネガティブ選抜法に基づくターゲティング遺伝子改変法を更に使い易く改変しながら、遺伝子機能情報に基づき耐病性やヒ素耐性の実用品種イネの開発を目指す。平成23年度はターゲティング遺伝子改変後に遺伝子領域に残るポジティブ選抜マーカーをCre-loxp部位特異的組換えシステムにより効率的に削除する"ターゲティング・セルフマーカーフリーシステム"の確立を目指した。そのためβ-estradiolとヒートショックにより活性化するプロモーターをCre遺伝子に連結し、Creの発現誘導により部位特異的組み換えが起きると、35SプロモーターとGUSが連結、発現するデザインのベクターを構築した。次いで、これらのベクターをそれぞれイネ・カルスに形質転換し、Cre発現のためのプロモーター活性化の条件検討を行い、部位特異的組み換え後のGUS発現の頻度を形質転換カルスで評価した。その結果β-estradiolの濃度、ヒートショックの時間に比例したGUS発現の頻度上昇が複数系統の形質転換カルスで検出された。しかし、誘導無しの条件でも幾つかのカルスではGUS発現が見られ、PCR解析の結果、これらのカルスでも部位特異的組み換えが生じていることも解った。再分化により誘導されるLeaf Panicle 2(LP2, Os02g40240)のプロモーターを用いたCre-loxpカセットについてはベクター構築が終了し、カルスへの形質転換を継続した。また、ポジティブ選抜に可視化マーカーを加えたターゲティング・ベクターを構築し、ターゲティングを行った後にCre遺伝子導入によるマーカーフリーを行うベクターの構築も進めた。ヒ素耐性遺伝子PvACR3を米国パデュー大学J. Banks教授との共同研究により入手し形質転換イネを作出した。今後の解析でヒ素耐性の検定を行う予定である。奈良先端大学院大学、島本功教授のグループとの共同研究でOsRac1ターゲティング改変イネを作出して耐病性の解析を進めたが、さらにOsGef7遺伝子の点変異導入のターゲティングを加える予定でベクター構築を進めた。セルフマーカーフリーシステムに組み込むことを念頭に基本ベクターの改良も進めた。
2: おおむね順調に進展している
ターゲティング・セルフマーカーフリーシステムの構築に関しては、Creの発現誘導に用いるプロモーターの有効性をGUS発現で判定できるシステムを構築した。さらに、ポジティブ選抜と可視化マーカーを連結したターゲティング・ベクターの構築も進め、ターゲティング・セルフマーカーフリーシステムのベクター準備が整っている。また、ヒ素耐性PvACR3形質転換イネも作出し種子形成が進んでいる。いもち病耐性については、OsGef7遺伝子のクローニングを終了した。
ターゲティング・セルフマーカーフリーシステムの構築では、Cre遺伝子の発現誘導にβ-estradiolとヒートショック活性化するプロモーターでリーキーな発現活性の可能性も示唆されたため、その原因を調べつつ、ポジティブ選抜マーカーの削除を可視化マーカーの発現によって識別できる様なターゲティング・ベクターの構築しも進めた。ターゲティング後のマーカーフリーが効果的に行えるベクターの探究を進めながら、耐病性とヒ素耐性のターゲティング形質転換イネからのマーカー削除を行い、次いで、これらのターゲティング形質転換イネの機能解析を進める。
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The Plant Journal
巻: 71 ページ: 564-574
10.1111/j.1365-313X.2012.05009.x
巻: 71 ページ: 85- 98
10.1111/j.1365-313X.2012.04974.x
