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“ターゲティング・セルフマーカーフリーシステム”による遺伝子改変法を確立するため､奈良先端大学院大学、島本功教授のグループで研究されている耐病性遺伝子の点変異導入ターゲティングにLP2セルフマーカーフリーシステムを組み込んだポジティブ・ネガティブ選抜ベクターが完成したので､このベクターを耐病性研究に用いられるキンマゼ品種の種子カルスに対してターゲティングを行った。その結果､500種子由来のカルスに対して40以上のターゲティングカルスを得ることに成功した。更にこれらのカルスを系統別に再分化誘導を行い、再分化植物におけるポジティブ選抜マーカーのセルフマーカーフリーの効率をPCR法によって調べたところターゲティング再分化植物でポジティブ選抜マーカーの削除が確認できるカルスが確認できた。塩基置換の導入の有無についてシークエンス解析を継続している。LP2セルフマーカーフリーシステムによるターゲティングの汎用性を調べるために、島本功教授、辻博士､田岡博士との共同研究でイネフロリゲン遺伝子のアミノ酸改変用のベクターも構築したが、これまでのLP2セルフマーカーフリーターゲティングと比較するとターゲティング頻度が非常に低くなるため、ポジティブ・ネガティブ選抜段階でのカルス維持に問題が生じることがわかった。そのため､イネフロリゲン遺伝子のアミノ酸改変にはターゲティング遺伝子改変後にCre遺伝子を再挿入して、ポジティブマーカーを削除する「２段階マーカーフリーシステム」を適用することが効果的と判断して、ターゲティングのベクターを再構築して、日本晴れ種子由来カルスにターゲティングとポジティブ・ネガティブ選抜を行い､ターゲティングカルスの選抜を進めている。ターゲティングカルスが取れた場合は、これまでの成果よりヒートショックプロモーターCre-loxP カセットの形質転換を行う。
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