| 研究課題/領域番号 |
23380206
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| 研究機関 | 大阪府立大学 |
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研究代表者 |
小泉 望 大阪府立大学, 生命環境科学研究科(系), 教授 (20252835)
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| 研究期間 (年度) |
2011-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | 小胞体ストレス応答 / 細胞質スプライシング / RNA分解 / シロイヌナズナ / 転写因子 |
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| 研究概要 |
シロイヌナズナの膜結合型転写因子であるbZIP60とbZIP28の活性化機構、さらに前年度の研究で明らかとなったbZIP60の活性化に関わるIRE1に着目し、小胞体ストレス応答の分子機構を中心に以下の研究を行った。
IRE1遺伝子破壊株はツニカマイシンに対して感受性を示すが、bZIP60遺伝子破壊株は感受性を示さないことから、IRE1はbZIP60 mRNAの細胞質スプライシング以外の機能を持つと考えられた。マイクロアレイ解析の結果を詳細に解析した結果、野生型では小胞体ストレスにより、小胞体で合成されるタンパク質をコードする遺伝子の転写産物（mRNA）が分解されるのに対して、IRE1遺伝子破壊株では分解が見られないことが示された。定量的PCR等による詳細な解析からIRE1が小胞体ストレス依存的に小胞体で合成されるタンパク質のmRNAを分解することが示された。
病原菌応答で重要な役割を果たすサリチル酸処理によりbZIP60の活性化が見られることを発見した。遺伝子破壊株を用いた解析から、この活性化はIRE1に依存することが明らかとなった。bZIP60の活性化機構を詳細に解析するため、変異導入したbZIP60遺伝子をbZIP60遺伝子破壊株に導入した。
BiP3プロモーター制御下で働くGUS遺伝子が恒常的に発現している2つの変異体に関して、次世代シーケンサーを用いた解析により、１つの変異体に関しては原因遺伝子の同定に成功した。
bZIP28にFLAGタグを付加した遺伝子を導入したトランスジェニック植物が得られたが、ウエスタンブロットの結果は明瞭で無く、bZIP28の切断を検出する系の確立には至らなかった。一方、S2P破壊株では小胞体関連遺伝子の誘導が抑制されるのに対し、S1P破壊株では抑制は見られず、S1PがbZIP28の切断に関与しない可能性が示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
IRE1は酵母、動物まで広く保存されている小胞体ストレスセンサーで、bZIP型転写因子mRNAの細胞質スプライシングを触媒する。さらに、動物のIRE1は小胞体で合成されるタンパク質のmRNAを分解するなど多くの機能を持つ。植物のIRE1については殆ど知見が無かったが、昨年度のbZIP60 mRNAの細胞質スプライシングの発見に続き、IRE1によるmRNA分解を発見し、PNAS誌に報告できたことは研究開始時に想定していなかった大きな進展と考えている。
サリチル酸によるbZIP60の活性化に関しては本研究遂行中に米国のグループから論文発表が行われたが、我々のデータとは合致しない。本研究の成果が正しいことを示す複数の結果を得ており、早い時期に論文発表を行いたい。
恒常的にBiP3プロモーターに制御されるGUS活性を示す変異体の遺伝子同定は次世代シーケンサーの利用により、当初の想定よりも非常に迅速に行うことができた。一方、この変異体はGUS活性に加えてBiP3タンパク質も恒常的に発現しているが、GUSおよびBiP3のmRNAの恒常的な発現が確認できておらず、その原因の解明は今後の課題である。
bZIP28のS1PとS2Pによる2段階の切断が定説となりつつあるが、S1Pが関与していない可能性が示され、bZIP28の切断機構を再考する必要が生じた。そのためには、bZIP28の切断を効率よく、また、再現性良く検出する実験系の構築が必要である。
IRE1によるmRNA分解機構の発見など、当初の計画以上に進展した部分がある一方でbZIP28の発現に関しては明確な結果が得られていない。総合的に考慮すれば、おおむね順調に進展していると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
IRE1の遺伝子破壊株はツニカマイシンに対して感受性を示すが、この際、プログラム細胞死が起こっている。このプログラム細胞死の亢進は、bZIP60の細胞質スプライシングとは無関係と考えられ、IRE1によるmRNA分解が原因と考えられる。その確認のため、変異導入を行ったIRE1をIRE1遺伝子破壊株に導入し、細胞死への影響を観察する。また、IRE1によるmRNA分解がタンパク質合成に与える影響についても解析を行う必要がある。そのためにIRE1の標的となるmRNAがコードしているタンパク質に対する抗体を作製し、タンパク質の挙動を調べる。
恒常的にBiP3プロモーターに制御されるGUS活性を示す変異体の１つは原因遺伝子が同定できているが、もう１つは候補遺伝子が7つにまで絞られているが特定には至っていないので、その特定を進める。またmRNAレベルがタンパク質レベルと対応しない原因の解明を行う。
bZIP28の切断を確認する系の確立は必須なので、GFPの蛍光観察の技術レベルを上げることを目指す。共焦点蛍光顕微鏡が共通機器として導入されたので、その利用により解決を図る。また、bZIP28を検出できる特異抗体の調整をおこない、S1P、S2PのbZIP28切断への関与を明らかにする。
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