破骨細胞膜に共存する空胞型プロトンポンプと電位依存性プロトンチャネルの機能

2013 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 23390043
• 研究機関: 大阪市立大学
• 研究代表者: 久野 みゆき 大阪市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (00145773)
• 研究分担者: 酒井 啓 大阪市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 研究員 (90382192)
• 研究期間 (年度): 2011-04-01 – 2014-03-31
• キーワード: 生理学 / 生体分子 / 細胞・組織 / 生理活性 / シグナル伝達 / プロトン

研究概要

1) V-ATPaseによるH+チャネル内胞化の検討.　NH4Clを用いた実験から、細胞内pHが6.5以上に5分以上曝されるとH+チャネルの内胞化が始まりpH 7.5前後まで増強することが明らかになった。細胞内pH（SNARF）と膜の蛍光マーカー（FM1-43）を用い、破骨細胞の細胞膜に存在するH+ポンプ（V-ATPase）による細胞内pH上昇がendocytosisを促進させる事を確認した。更にH+チャネル頻回刺激による細胞内pH上昇でもチャネルの内胞化を生じた。外因性、内在性いずれのpH上昇刺激によるendocytosis促進もdynaminに依存した。同様の現象はマイクログリアでも起こったが、H+チャネル遺伝子を発現させたCOS細胞では見られなかった。以上の結果より、破骨細胞やマイクログリアでは生理的な細胞内pHでH+チャネルの約40%は細胞内プールに存在し、刺激に応答し細胞膜に移動する事が推測された。これはH+チャネル活性の新しい調節メカニズムである。2) 骨代替基質の開発. 魚燐上に分化させた破骨細胞でV-ATPaseとH+チャネルの干渉はガラス面に分化させた場合に比較し少なかった。研究を続行し干渉の抑止機構・機能的距離を解明したい。3) phagosomeにおけるV-ATPaseとH+チャネルの干渉/ H+チャネル分子のH+センサー機能.　H+電流と蛍光の同時測定のためPhotometry systemを設置した。現在、H+チャネル活性と蛍光マーカー（FITC）をつけたzymosan貪食胞のpHの同時記録、H+チャネル逆転電位による細胞膜近傍pHとSNARFによる細胞内バルクpHの同時記録の予備実験を行っており、細胞内pH動態解析の新規手法として確立することを目指している。成果の一部は論文２報および国内外の学会・研究会（計７回）で発表した。

現在までの達成度 (区分)

理由

25年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

25年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] The effect of lipid emulsion on intracellular bupivacaine as a mechanism of lipid resuscitation: An electrophysiological study using voltage-gated proton channels. (2013)
  • 著者名/発表者名: Hori K, Matsuura T, Mori T, Kuno M, Sawada M and Nishikawa K.
  • 雑誌名: Anesthesia & Analgesia 巻: 117 ページ: 1293-1301
  • DOI: 10.1213/ANE0000000000000011
  • 査読あり
• [雑誌論文] Increases in intracellular pH facilitate endocytosis and decrease availability of voltage-gated proton channels in osteoclasts and microglia. (2013)
  • 著者名/発表者名: Sakai H, Li G, Hino Y, Moriura Y, Kawawaki J, Sawada M and Kuno M
  • 雑誌名: Journal of Physiology (London) 巻: 591 ページ: 5851-5866
  • DOI: 10.1113/jphysiol.2013.263558
  • 査読あり
• [学会発表] 細胞内pH上昇によるエンドサイトーシスの促進と電位依存性プロトンチャネルの内包化機構 (2014)
  • 著者名/発表者名: 久野みゆき、李光師、日野佳子、森浦芳枝、川脇順子、酒井啓
  • 学会等名: 第91回日本生理学会大会
  • 発表場所: 鹿児島大学
  • 年月日: 20140316-20140318
• [学会発表] Depolarizing Membrane Potential by PTH and VD3 Regulates RANKL-intracellular Transportation; A Novel Mechanism of PTH- and VD3-induced Osteoclastogenesis (2013)
  • 著者名/発表者名: Takuya Notomi, Miyuki Kuno, Yoichi Ezura, Masaki Noda
  • 学会等名: 第35回米国骨代謝学会（ASBMR)
  • 発表場所: ボルチモア国際会議場、米国
  • 年月日: 20131004-20131007
• [学会発表] 細胞内pHによるエンドサイトーシスとプロトンチャネルの制御について (2013)
  • 著者名/発表者名: 久野みゆき、李光師、日野佳子、森浦芳枝、川脇順子、酒井啓
  • 学会等名: 平成25年度生理学研究所研究会
  • 発表場所: 生理研研究所大講義室、岡崎市
  • 年月日: 20130926-20130927
  • 招待講演
• [学会発表] 酸性環境に暴露される細胞膜およびlysosome膜のプロトンflux機構。 (2013)
  • 著者名/発表者名: 久野みゆき、海住太郎
  • 学会等名: 平成25年度生理学研究所研究会
  • 発表場所: 生理研研究所大講義室、岡崎市
  • 年月日: 20130905-20130906
  • 招待講演
• [学会発表] The recovery speed of lipid emulsion therapy largely depends on “lipid sink”: An electrophysiological study using voltage-gated proton channels. (2013)
  • 著者名/発表者名: Hori, K., Matsuura, T., Hasaka, M., Mori, T., Kuno, M, Nishikawa,K.
  • 学会等名: Euroanesthesia 2013 (ヨーロッパ麻酔学会)
  • 発表場所: バルセロナ国際会議場、スペイン
  • 年月日: 20130601-20130604
• [学会発表] Intracellular pH levels regulate the amount of available voltage-gated proton channels in the plasma membrane of murine osteoclasts. (2013)
  • 著者名/発表者名: Kuno M and Sakai H.
  • 学会等名: 2nd Joint Meeting of the International Bone and Mineral Society and The Japanese Society for Bone and Mineral Research (IBMS-JSBMR)
  • 発表場所: 神戸国際会議場
  • 年月日: 20130528-20130601
• [学会発表] Lipid rescueにおける”lipid sink”の効果発現時間について―電位依存性プロトンチャネルによる検討― (2013)
  • 著者名/発表者名: 堀耕太郎、松浦正、羽阪めぐみ、森隆、久野みゆき、西川精宣
  • 学会等名: 第60回日本麻酔科学会学術集会
  • 発表場所: 札幌市教育文化会館ほか
  • 年月日: 20130523-20130525
• [備考] 分子細胞生理学
  • URL: http://www.me.osaka-cu.ac.jp/molcelphysiol/
• [備考] 電位依存性プロトンチャネルのイオン透過性の温度依存性
  • URL: http://physiology.jp/exec/page/stopics66