研究課題
Down症新生児の約10％に前白血病TAMが発症し、その20%は骨髄性白血病 (ML-DS) を発症する。GATA1の質的・量的異常による白血病発症の仕組みを解明することを目的として、本年度は以下の研究を進めた。1. 我々が同定した内部欠失GATA1変異体 (GATA1 ID) などの変異GATA1蛋白の機能解析を進めた。GATA1 ID2はIDのみが発現しているので、TAMの発症に直接関わっていると考えられる。しかし、ID1はいつもGATA1sと一緒に発現しているので、GATA1sのみが発現しているML-DS細胞株KPAM1にGATA1 ID1を発現させ、細胞増殖に及ぼす影響を調べた。GATA1は細胞増殖を効率的に抑えられるのに対して、GATA1 ID1とID2は細胞増殖を抑えられないことが明らかになった。さらにRB結合モチーフを壊した変異体も細胞増殖を抑制できなかった。2. GATA1のRB結合モチーフにRB蛋白が実際に結合しているか解析した。この目的のために、in vitroで発現させたRB蛋白をベイトにしたGSTプルダウンアッセイを開発した。その結果、wild type GATA1はBBと結合するが、GATA1sとの結合は極めて弱く、IDやRB結合モチーフを壊したGATA1はRB蛋白との結合が減弱していることが明らかになった。しかし、通常の免疫沈降法では、GATA1とRB蛋白が結合している証拠は得られなかったことから、RB以外の蛋白が結合している可能性が示唆された。3. TAMの臨床検体を用いて、発現アレイで網羅的な発現解析を行った。その結果、GATA1s低発現変異をもつTAM細胞は、マスト細胞特異的遺伝子が高発現していることが明らかになった。これは、GATA1sの発現量がTAMの血球分化に影響することを示唆している。
2: おおむね順調に進展している
Down症新生児の約10％に前白血病TAMが発症し、その20%は骨髄性白血病 (ML-DS)を発症する。我々は、GATA1遺伝子変異がTAMとML-DSで高率にみられ(Blood 2003)、変異GATA1蛋白（GATA1s）の低発現変異は白血病発症のリスクファクターであることを発見した。本研究の目的は、GATA1の質的・量的異常による白血病発症の仕組みを解明することである。現在までに以下の研究成果が得られ、概ね順調に進展している。1. GATA1の質的異常が正常造血を障害する仕組みを解明する。TAM細胞に生じている内部欠変異GATA1 (GATA1 ID)の機能解析から、巨核球やML-DS細胞の異常増殖を抑制するGATA1の最小領域 (RB結合配列) を決定することができた。さらに、N末端の63アミノ酸までの領域も巨核球の増殖抑制に重要であることを見出した。GATA1にRB蛋白が直接結合しているかどうかを知るために、in vitroで発現させたRB蛋白をベイトにしたGSTプルダウンアッセイを開発し、GATA1のRBとの結合にはRB結合配列が重要であることを明らかにした。しかし、通常の免疫沈降法では、GATA1とRB蛋白が結合している証拠は得られなかったことから、in vivoでの証明がさらに必要である。2. GATA1sの発現量が、白血病発症にどのような仕組みで影響するかを明らかにする。GATA1s高発現変異をもつTAM細胞は、GATA1s低発現変異を持つTAMに比べて、巨核球特異的遺伝子の発現量が上昇していることが明らかになった。一方、GATA1s低発現変異をもつTAM細胞は、マスト細胞特異的遺伝子が高発現していることが明らかになった。これらの結果は、GATA1sの発現量がTAMの血球分化に影響することを示唆している。
1. 巨核球の異常増殖を抑制するGATA1 N末端領域の最小領域の同定とその領域に領域に結合する分子の同定し、GATA1の質的異常が正常造血を障害する仕組みの解明する。我々は、2種類のGATA1 ID変異体に加えて、新たなID3を同定した。この変異体も含めさらに新たなGATA1変異を作成し、機能解析を進める。平成２４年度には、RB蛋白がGATA1とin vitroの系で結合することを見出した。In vivoでもその結合を証明するために共沈実験を行う。即ち、RB動物細胞発現ベクター(FLAG tag付き)を作成し、正常GATA-1およびN末端転写活性化ドメインを欠くΔGATA-1発現ベクターとともにCOS-7細胞に遺伝子導入し、抗FLAG抗体(M2)で免疫し、その後、ウエスタンブロットで展開し、抗GATA-1抗体(M-20)で直接結合しているかを解析する。2. GATA1s発現量の白血病発症に対する影響の解明する。ML-DS細胞株で得られた研究成果を踏まえ、CD34抗体で選択したTAM細胞あるはML-DS細胞にGATA1 shRNA発現ベクター（レンチウイルスベクター）を遺伝子導入し、Puromycinで選択する。液体培地、およびメチルセルロースを用いた半固形培地で培養しDoxycylineを用いてGATA1 shRNAを誘導し、GATA1sの発現量を抑制し、増殖能、遺伝子発現をmicro arrayなどを用いて解析する。3. GATA1と共同して働く21番染色体上の遺伝子を同定する。胎児幹細胞由来のストロマ細胞株などを用いて、TAMの長期培養系の確立を継続する。次にTAM細胞で発現している２１番染色体上の遺伝子を誘導可能なshRNA発現ベクターでノックダウンし、ダウン症の白血病発症に関わる重要な遺伝子を同定する。
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