| 研究概要 |
ある蛋白がどのように生体で機能しているかを調べる最も直接的な方法のひとつに,その蛋白の遺伝子を破壊したノックアウト(KO)マウスの解析がある.しかし,KOマウスでは胚の段階から目的の遺伝子が破壊されているため,その蛋白が生体にとって重要なものであればKOマウスは生存できないことも多い.そこで,コンディショナル(con)KOマウスが開発された.このcon KOマウスでは胚の段階では遺伝子が機能するが,ある薬剤を投与すると遺伝子が破壊されノックアウト状態が作られる.しかしながら,その作成には多大な労力,時間,資金がかかる。そこで申請者は,遺伝子を破壊するのではなく,任意の時期に目的の蛋白そのものを分解できる画期的なcon KOマウス作成法を着想した.本研究の目的は、オーキシン分解システムを生体の細胞で実現し,オーキシン全身投与あるいは皮膚に外用することにより,自由な時期に標的蛋白を破壊できる画期なマウスモデルシステムを開発することである。本年度は、分解'TAGを持つBP180遺伝子をもつトランスジェニックマウス(TG)の作成を試みた.すなわち、当教室ではヒトBP180のcDNA遺伝子があるので,それをもとにBP180のN末端にTAGを有するTAG-BP180遺伝子を構築した.なお,BP180はN末端に細胞外分泌に関連するsignalsequenceがなくN末端がのこるので,分解TAGはN末端に付加した.そのTAG-BP180遺伝子にK14プロモーターを有するTGマウス用のコンストラクトを組み込んだ.また、分解TAGを持つSERCA2遺伝子をもつTGマウスの作成も同様に試みた.手順は、SERCA2のDNA遺伝子を有しているので,それをもとにN末端とC末端にTAGを有するTAG-SERCA2遺伝子を構築する.そのTAG-SERCA2遺伝子をK14プロモーターを有するTGマウス用のコンストラクトに組み込む.次に、培養細胞にそのコンストラクトとTIR遺伝子の発現ベクターを加え,オーキシン添加によってSERCA2が分解されるかを確認した.
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