| 研究課題/領域番号 |
23390404
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| 研究機関 | 京都府立医科大学 |
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研究代表者 |
木下 茂 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (30116024)
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| 研究分担者 |
川崎 諭 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (60347458)
上野 盛夫 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (40426531)
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| 研究期間 (年度) |
2011-04-01 – 2014-03-31
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| キーワード | 角膜上皮細胞 / コア因子 |
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| 研究概要 |
角膜上皮細胞のコア因子の同定のためのスクリーニングのために、shRNAライブラリーを作成する予定であったが、様々な状況を勘案し、iPS干渉法（Hikichi et al:PNAS, 2013)を用いることとした。まずマイクロアレイで、角膜上皮細胞を結膜上皮細胞、ES細胞、心筋細胞、皮膚繊維芽細胞の遺伝子発現レベルと比較し、角膜上皮細胞で高発現している転写因子、146因子を候補コア転写因子とした。それらの候補因子を1つずつ、Oct3/4、Sox2、KLF4、MYCとともに角膜上皮細胞に遺伝子導入を行い、iPS細胞へのリプログラミングの阻害効果を検討した。iPS干渉法を始める前に、角膜上皮細胞からiPS細胞へのリプログラミング効率について検討し、0.6～1.0%の効率で安定して角膜上皮細胞からのiPS化が可能であるプロトコールを確立した。次にiPS干渉法を行い、角膜上皮細胞からのiPS化効率を30%にまで低下させる因子を20因子同定した。強くiPS干渉した20因子を様々に組み合わせて、新生児繊維芽細胞に遺伝子導入を行い、角膜上皮細胞への分化転換が可能かどうかを細胞形態、遺伝子発現レベルにおいて検討した。いくつかの転写因子セットでは繊維芽細胞から上皮細胞様の形態に変化し、E-cadehrinの発現上昇を確認した。さらに、その中からp63α、Keratin15の発現が上昇している細胞群を同定した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
約2000個ある転写因子の中から146因子にまで絞り込むことができ、さらにiPS干渉法によって20因子にまで絞り込むことができた。そして、それらの転写因子セットを導入することで繊維芽細胞から少なくとも上皮系への分化転換を可能とした。
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| 今後の研究の推進方策 |
20の候補転写因子から最適な転写因子セットを絞り込むために、様々な組合わせで繊維芽細胞に遺伝子導入を行い、角膜上皮細胞への遺伝子プロファイルの再現を検討する。繊維芽細胞から角膜上皮細胞への分化転換はまだ成功しておらず、培養条件、培養期間、転写因子セットの組み合わせ、遺伝子導入時期、導入遺伝子の量比などの検討が必要である。また分化転換された細胞集団を濃縮するためにセルソーターを用いて検討する。
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