ナノライブイメージング技術を用いた新規免疫系ＮＥＴｓ誘導因子の多次元解析

2012 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 23390419
• 研究機関: 新潟大学
• 研究代表者: 寺尾 豊 新潟大学, 医歯学系, 教授 (50397717)
• 研究分担者: 川端 重忠 大阪大学, 歯学研究科(研究院), 教授 (50273694) ; 中田 匡宣 大阪大学, 歯学研究科(研究院), 准教授 (90444497)
• 研究期間 (年度): 2011-04-01 – 2014-03-31
• キーワード: NETs

研究概要

計画2年目には，原子間力顕微鏡に超高速撮影機能ならびに高速画像解析機能を追加した．平成21～22年度採択の科学研究費補助金を用いた研究で，培養細胞や活性型タンパク，さらには生菌等の湿潤試料をナノスケールで観察する条件設定を確立することが可能となり始めていた．そこで，さらに1秒間に10コマ以上の撮影能力を有するスキャナー消耗品を必要最低限度かつ最適な装備に絞り込んで選定し交換した．この更新システムを用いて，初年度計画において選出したレンサ球菌（まずは生きた全菌体）が，好中球表層に作用しNETs誘導を起こす過程を一分子ごとにリアルタイム画像で追跡し，超微細形態学的に解析した（担当：寺尾）．
上記までの実験計画が順調に進捗したため，初年度に同定したNETs発現を亢進あるいは阻害するA群レンサ球菌由来の分子や，それらの特異抗体の投与によるNETs免疫コントロール法についても検討を加え始めた．また，一連の実験過程で得られた材料を用いて，NETs発現に関与する好中球レセプターの検索も行った（担当：川端・中田）．
その結果，好中球細胞にNETs発現を誘導するレンサ球菌由来の分子の同定に成功した．当該分子は，ゲノムデータベースを用いたin silico法と旧来からの生化学的in vitro分析法の組み合わせにより，Streptococcus pneumoniae alpha-enplaseと決定できた．

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本年度の研究計画で提唱した仮説を裏付けるような，好中球NETs誘導タンパク質を肺炎レンサ球菌のタンパク画分から発見し，さらに同分子を同定・分離できた．そして，その研究成果を専門分野の英文雑誌に投稿し，これが査読を受けて受理されたことから，おおむね当初の計画通りに進展していると考える．

今後の研究の推進方策

レンサ球菌由来のNETs免疫系作動因子の多次元ナノライブイメージング同定
本申請計画の最終年度では，初年度に構築したレンサ球菌のNETs誘導因子の候補ライブラリー（組換え体，精製細胞壁，および遺伝子欠失変異株）を用いて，計画２年目に至適化した顕微鏡観察技術に供し，好中球NETs系を誘導する細菌因子の詳細な同定とメカニズム解析を試みる（担当：寺尾）．
(1)ヒト好中球にレンサ球菌の組換えタンパク，精製細胞壁，遺伝子欠失変異株（平成23年度に作製分）を添加し，平成24年度に至適化した顕微鏡システムでNETs誘導能を観察する． (2) バックアップ実験として行う平成23年度の現況顕微鏡システムで同定したNETs誘導因子群と比較し，一致した因子を以下のマウス動物実験に用いることとする．(3) in vitro実験で同定されたNETs誘導因子は，マウス接種実験に備え，大量発現系および精製系の至適化を行う．そのために，初年度で購入した各種の組換えタンパク発現系を使用するほか，特異的抗血清を利用した精製用アフィニティーカラムも作製する．抗血清の完成には，３ヶ月程度の時間を要するため，その作製はNETs誘導因子の候補が同定され次第，逐次実施する．
マウスモデルを用いたNETs免疫系作動因子の同定と感染防御効果の検索
さらに，上記のin vitro実験系で同定したNETs誘導因子をマウス動物モデルに供し，in vivo実験下におけるNETs誘導の検索を行う．また，NETs誘導がマウスモデルで確認された場合は，院内感染の主要な起因菌として問題化しているMRSA（多剤耐性黄色ブドウ球菌）の感染実験を行う（担当：寺尾・川端・中田）．

研究成果

• [雑誌論文] Neonatal pleural empyema caused by emm type 6 group A Streptococcus. (2014)
  • 著者名/発表者名: Nohara, F., Nagaya, K., Asai, H., Tsuchida, E., Okamoto, T., Hayashi, T., Sakata, H., Terao, Y., and Azuma, H.
  • 雑誌名: Pediatirics International 巻: in press ページ: in press
  • 査読あり
• [雑誌論文] Cysteine proteinase from Streptococcus pyogenes enables to evade innate immunity via degradation of complement factors. (2013)
  • 著者名/発表者名: 5. Honda-Ogawa, M., Ogawa, T., Terao, Y.*, Sumitomo, T., Nakata, M., Ikebe, K., Maeda, Y., and Kawabata, S.
  • 雑誌名: J. Biol. Chem. 巻: 288 ページ: 15854-15864
  • 査読あり
• [雑誌論文] Group A streptococcal cysteine protease cleaves epithelial junctions and contributes to bacterial translocation. (2013)
  • 著者名/発表者名: Sumitomo, T., Nakata, M., Higashino, M., Terao, Y., and Kawabata, S.
  • 雑誌名: J. Biol. Chem. 巻: 288 ページ: 13317-24
  • 査読あり
• [雑誌論文] Hydrogen peroxide produced by oral streptococci induces macrophage cell death. (2013)
  • 著者名/発表者名: Okahashi, N., Nakata, M., Sumitomo, T., Terao, Y., and Kawabata, S.
  • 雑誌名: PLoS one 巻: 8 ページ: e62563
  • 査読あり
• [雑誌論文] The virulence factors and pathogenic mechanisms on Streptococcus pyogenes. (2013)
  • 著者名/発表者名: Yamaguchi, M., Terao, Y., and Kawabata, S.
  • 雑誌名: Cell. Microbiology 巻: 15 ページ: 503-511
  • 査読あり
• [雑誌論文] MicroRNA fragments derived from Streptococcus pyogenes enable activation of neutrophil phagocytosis: in vitro study. (2013)
  • 著者名/発表者名: Ogawa, T., Terao, Y., Honda-Ogawa, M., Hashimoto, S., Ikebe, K., Maeda, Y., and Kawabata, S.
  • 雑誌名: Microb. Infect. 巻: 15 ページ: 212-218
  • 査読あり
• [雑誌論文] Group A streptococcus adheres to pharyngeal epithelial cells with salivary proline-rich proteins via GrpE chaperone protein. (2012)
  • 著者名/発表者名: Murakami, J., Terao, Y., Morisaki, I., Hamada, S., and Kawabata, S.
  • 雑誌名: J. Biol. Chem. 巻: 287 ページ: 22266-22275
  • 査読あり
• [雑誌論文] α-enolase of Streptococcus pneumoniae induces formation of neutrophil extracellular traps. (2012)
  • 著者名/発表者名: Mori, Y., Yamaguchi, M., Terao, Y., Hamada, S., Ooshima, T., and Kawabata, S.
  • 雑誌名: J. Biol. Chem. 巻: 287 ページ: 10472-10481
  • 査読あり
• [雑誌論文] Long-term survival of salivary streptococci on dental devices made of EVA. (2012)
  • 著者名/発表者名: Ogawa, T., Yamasaki, S., Honda, M., Terao, Y., Kawabata, S., and Maeda, Y.
  • 雑誌名: Int. J. Oral Science 巻: 4 ページ: 14-18
  • 査読あり
• [雑誌論文] S-carboxymethylcysteine inhibits adherence of Streptococcus pneumoniae to human alveolar epithelial cells. (2012)
  • 著者名/発表者名: Sumitomo, T., Nakata, M., Yamaguchi, M., Terao, Y., and Kawabata S.
  • 雑誌名: J. Med. Microbiol. 巻: 61 ページ: 101-108
  • 査読あり
• [学会発表] Moleculara mechanisms of complement evasion by Streptococcus pyogenes cysteine protease SpeB (2013)
  • 著者名/発表者名: 本多 真理子, 寺尾 豊, 住友 倫子, 中田匡宣, 川端 重忠
  • 学会等名: 第86回日本細菌学会総会
  • 発表場所: 千葉市
  • 年月日: 20130318-20
• [学会発表] Group A streptococcal cysteine proteases, SpeB and Sib35, cleave epithelial junctions (2013)
  • 著者名/発表者名: Tomoko Sumitomo, Miharu Higashino, Akari Kominami, Masanobu Nakata, Yutaka Terao, and Shigetada Kawabata
  • 学会等名: 第86回日本細菌学会総会
  • 発表場所: 千葉市
  • 年月日: 20130318-20
• [学会発表] Cell wall anchoring mechanism of FCT region type 3 pili in Streptococcus pyogenes (2013)
  • 著者名/発表者名: Masanobu Nakata, Tomoko Sumitomo, Yutaka Terao, Shigeyuki Hamada, and Shigetada Kawabata
  • 学会等名: 第86回日本細菌学会総会
  • 発表場所: 千葉市
  • 年月日: 20130318-20
• [学会発表] Streptococcus sanguinis induces foam cell formation and cell death of macrophages (2013)
  • 著者名/発表者名: N. Okahashi, T. Okinaga, A. Sakurai, Y. Terao, M. Nakata, S. Kawabata, T. Nishihara
  • 学会等名: 第86回日本細菌学会総会
  • 発表場所: 千葉市
  • 年月日: 20130318-20
• [学会発表] Streptococcus pyogenesのシステインプロテアーゼSpeBによる補体免疫回避機構の解析
  • 著者名/発表者名: 本多 真理子，橋本 栄，寺尾 豊，川端 重忠
  • 学会等名: 第21回Lancefieldレンサ球菌研究会
  • 発表場所: 吹田市
• [学会発表] T6線毛のバイオフィルム形成と菌体凝集への関与
  • 著者名/発表者名: 森田 知里，中田 匡宣，木村 敬次Richard，住友 倫子，寺尾 豊，川端 重忠
  • 学会等名: 第21回Lancefieldレンサ球菌研究会
  • 発表場所: 吹田市
• [学会発表] Streptococcus pyogenesのシステインプロテアーゼSpeBが補体免疫機構に及ぼす影響
  • 著者名/発表者名: 本多 真理子，寺尾 豊，川端 重忠
  • 学会等名: 第65回日本細菌学会関西支部総会
  • 発表場所: 神戸市
• [学会発表] ヒト補体免疫系回避機構におけるStreptococcus pyogenes 分泌型プロテアーゼSpeBの機能解析
  • 著者名/発表者名: 本多 真理子，寺尾 豊，住友 倫子，中田 匡宣，川端 重忠
  • 学会等名: 第5回口腔環境制御」カテゴリー集会
  • 発表場所: 長崎市
• [図書] 化学療法の領域（レンサ球菌感染症の予防・治療法の確立に向けた展望） (2013)
  • 著者名/発表者名: 寺尾 豊
  • 総ページ数: 3
  • 出版者: 株式会社医薬ジャーナル社
• [備考] 新潟大学大学院医歯学総合研究科微生物感染症学分野
  • URL: http://www.dent.niigata-u.ac.jp/microbio/microbio.html
• [備考] 感染免疫現象のバイオイメージング解析
  • URL: http://www.niigata-univ-mid.net/study/index.html
• [備考] アウトリーチ活動の案内
  • URL: http://www.niigata-univ-mid.net/about_us/index.html
• [備考] 研究内容とアウトリーチ活動の問合せ窓口
  • URL: http://www.niigata-univ-mid.net/contact/index.html