αシヌクレインの神経細胞生物学的研究

2011 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 23500408
• 研究機関: (財)東京都医学総合研究所
• 研究代表者: 上田 健治 (財)東京都医学総合研究所, 認知症・高次脳機能研究分野, 主任研究員 (90261180)
• 研究期間 (年度): 2011-04-28 – 2014-03-31
• キーワード: αシヌクレイン / ミトコンドリア / 神経変性

研究概要

αシヌクレインは神経変性疾患の鍵分子の一つであり、これまで多くの病理的側面の研究が成されているが、αシヌクレインの生理機能の詳細は依然不明のままである。αシヌクレインが関与する神経疾患の分子病理の真の理解にはαシヌクレインの生理機能を知ることが重要である。生理的状態を熟知してこそ病理的状態を良く知り得る。　最近、我々はαシヌクレインが神経細胞のミトコンドリアに局在する事を見出した。ミトコンドリア異常は神経変性疾患の分子病理でも重視されている。従って、本研究ではミトコンドリアにおけるαシヌクレインの病態生理機能を解明する事を目的とする。ミトコンドリアにおけるαシヌクレインの生理・病理機能を多面的に検討する目的で、今年度は先ずラット脳から調製したミトコンドリアを用いて、αシヌクレインと作用するタンパク質の同定を試みた。ラット脳からミトコンドリアを調製し、抗αシヌクレイン抗体EQV-1で共免疫沈殿(Co-IP)を行ったところ、mitochondrial permeability transition pore (mPTP)を構成するタンパク質、adenylate translocatorが検出された。この点をさらに確認する為に、共免疫沈殿(Co-IP)に特異抗体EQV-1(NAC領域)の他に、抗αシヌクレイン C末端特異抗体 PQE-3も利用したところadenylate translocatorと共沈殿する事が再確認された。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

我々は、αシヌクレインが神経細胞のミトコンドリア内膜に局在する事を見出し、αシヌクレインの濃度依存的に複合体Iの活性が低下する事を見出した（１）。しかもその濃度は1 pMという低濃度で効果がある事が判明した。従って、αシヌクレインはミトコンドリア機能の枢要なタンパク質、ないしは構造体に作用している事が推察された。これを踏まえて、ラット脳から分離・調整したミトコンドリアを用いてαシヌクレインが作用するタンパク質を検討したところ、adenylate translocator（ANT）が検出された。ANTはmitochondrial permeability transition pore (mPTP)の構成タンパク質である。mPTPはミトコンドリアの機能に重要な構造体であり、Ca2+によって構造変換を起こして開口脱分極し、ミトコンドリアのswellingを引き起こし外膜の崩壊を誘発し、内部のCa2+を放出し、近辺のミトコンドリアに悪影響を与えるストレスとなり、ひいてはアポトーシスに繋がり得る。その構成タンパク質の一つであるANTとαシヌクレインが作用する事が確認された点が意義深い。（１）Liu et al. (2009) α-Synuclein is differentially expressed in mitochondria from different rat brain regions and dose-dependently down-regulates complex I activity. Neurosci. Lett. 454: 187-192.

今後の研究の推進方策

培養神経細胞を用いてαシヌクレインを導入発現させ、ミトコンドリアに与える影響を詳細に検討する。細胞としては、ドーパミン系神経細胞株SH-SY5YとMN9D、そしてヒト胎児腎臓由来HEK293T株を採用する。定法でαシヌクレイン発現プラスミドを導入させ、免疫細胞化学、免疫蛍光染色、電子顕微鏡観察を行い、映像解析を行う。mPTP活性（開口）と膜電位ΔΨmを測定する。ΔΨm測定にはJC-1 (5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide)を用いる。JC-1の蛍光はΔΨmにのみ依存し、ミトコンドリアの大きさ、形態、濃度には依存しない。蛍光はFACSAria flow cytometer (Becton-Dickinson)で測定する。映像解析にはNanoScope III Dimension 3000 series BioScope (Molecular Imaging)を用いる。ミトコンドリアからCytochrome cが放出される可能性があり、InnoCyte Flow Cytometric Cytochrome C Release Kit (Calbiochem)を用いて解析する。その他に、adenylate translocatorの関与を傍証する為には、その阻害剤であるbongkrekic acidを用いる実験を行う。

次年度の研究費の使用計画

計画研究内容は分子生物学、生化学、細胞培養、免疫細胞化学、電子顕微鏡観察等、分子レベルから細胞レベルの試料を用いて、多様な実験手法を駆使して遂行されるべき内容であり、対応する消耗品類を用いる。また、研究代表者は２００１年１０月１１日付で北京首都医科大学客座教授・中日神経変性病研究聯合実験室室長(Co-Director)を兼任している。この共同研究室には正教授５人、助教授１人、研究員５人、技官５人、そして多数の大学院生が参加している。これらの海外共同研究者との緊密な共同研究の結果、研究成果得て今日に至っている。今後もこの共同研究を継続する事が双方にとって重要であり、研究室員との相互連絡を効率良くするためにも複数（年３、４回、各１、２週間）の研究打合せに要する外国旅費経費を計上する。

研究成果

• [雑誌論文] Melatonin reduces the expression of α-synuclein in the dopamine containing neuronal regions of amphetamine-treated postnatal rats (2012)
  • 著者名/発表者名: Sae-Ung K, Ueda K, Govitrapong P, Phansuwan-Pujito P
  • 雑誌名: J. Pineal Res. 巻: 52 ページ: 128-137
  • DOI: doi: 10.1111/j.1600-079X.2011.00927.x. Epub 2011 Aug 18.
  • 査読あり
• [雑誌論文] α-Synuclein promotes clathrin-mediated NMDA receptor endocytosis and attenuates NMDA-induced dopaminergic cell death. (2011)
  • 著者名/発表者名: Cheng F, Li X, Li Y, Wang C, Wang T, Liu G, Baskys A, Ueda K, Chan P, Yu S
  • 雑誌名: J. Neurochem. 巻: 119 ページ: 815-825
  • DOI: doi: 10.1111/j.1471-4159.2011.07460.x. Epub 2011 Oct 11.
  • 査読あり
• [雑誌論文] α-Synuclein functions as a negative regulator for expression of tyrosine hydroxylase (2011)
  • 著者名/発表者名: Li YH, Gao N, Ye YW, Li X, Yu S, Yang H, Ueda K, Chan P
  • 雑誌名: Acta Neurol. Belg. 巻: 111 ページ: 130-135
  • DOI: PMID: 21748932
  • 査読あり
• [雑誌論文] Increase expression of α-synuclein in aged human brain associated with neuromelanin accumulation. (2011)
  • 著者名/発表者名: Xuan Q, Xu SL, Lu DH, Yu S, Zhou M, Ueda K, Cui YQ, Zhang BY, Chan P
  • 雑誌名: J. Neural Transm. 巻: 118 ページ: 1575-1583
  • DOI: PMID: 21461961
  • 査読あり
• [雑誌論文] C-terminal part of α-synuclein mediates its activity in promoting proliferation of dopaminergic cells. (2011)
  • 著者名/発表者名: Yin J, Han J, Zhang C, Ma QL, Li X, Cheng F, Liu G, Li Y, Ueda K, Chan P, Yu S
  • 雑誌名: J. Neural Transm. 巻: 118 ページ: 1155-1164
  • DOI: PMID: 21331461
  • 査読あり
• [学会発表] Protective effect of melatonin on the dopamine pathway from amphetamine-induced neurotoxicity in postnatal rats (2011)
  • 著者名/発表者名: Sae-Ung K, Govitrapong P, Ueda K, Phansuwan-Pujito P
  • 学会等名: The 23rd Biennial Meeting of the International Society for Neurochemistry (ISN)
  • 発表場所: Athens, Greece
  • 年月日: 2011.08.31
• [学会発表] C-Terminal part of α-synuclein mediates its activity in promoting proliferation of dopaminergic cells (2011)
  • 著者名/発表者名: Yin J, Wang T, Han J, Zhang C, Ma Q, Li X, Cheng F, Liu G, Li Y, Uéda K, Chan P, Yu S
  • 学会等名: 2011 International Conference on Molecular Neurodegeneration
  • 発表場所: Shanghai, China
  • 年月日: 2011-09-22