| 研究課題/領域番号 |
23500413
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| 研究機関 | 琉球大学 |
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研究代表者 |
高山 千利 琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (60197217)
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| 研究期間 (年度) |
2011-04-28 – 2014-03-31
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| キーワード | GABA / GAD65/67 / VGAT / KCC2 / Spinal cord / immunohistochemistry / Cell migration / Synapse formation |
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| 研究概要 |
１．GAD67-GFP knock inマウスの解析 ヘテロマウスを用いて、GABAニューロンの脊髄における発生過程を解析した。その結果、腹側のGABAニューロンは３グループ有った。E10頃生まれる最初のニューロン群は交連線維を出し、その後消失した。次の２つのニューロンはそれぞれE11, E12~13に生まれ、腹側全体に分布した。この結果は、現在投稿中の(Kosaka et al.投稿中)と、ほぼ同じ結果であった。これまで、行うことが出来なかったKCC2抗体、VGAT抗体との２重染色が可能になったので、現在その詳細な時間的空間的変化の解析を行っている。２．KCC2-KOマウスの解析 (1) GABAシグナルに関連する分子（GABA、GABA合成酵素）、シナプス小胞関連タンパク質（VGAT, シナプトフィジン）、ポストシナプス：GABA受容体の足場タンパク質（gephyrin）の局在変化を解析した。(2) 脊髄を構成する各種ニューロンのマーカー(calbindin, carletinin, parvalbuminなど)の抗体を用いて形態を解析した。(3)substance P, CGRPなどの抗体を用いて後根線維を染色し、入力線維の分布変化を解析した。以上を、野生型とホモマウスで詳細に比較検討した。しかしながら、今のところ異常は発見されていない。３．GAD75/67 double KOマウス、VGAT-KOマウスなどは現在ホモマウスを得るための繁殖を開始している段階で解析が進んでいない。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
１．3/11東日本大震災後の計画停電などのため、連携研究者の所属する群馬大学の動物施設でのGAD65/67 double KOマウス、VGAT KOマウスの繁殖が制限され、琉球大学への移送が大幅に遅れた。また、琉球大学での維持系統がなかなか安定せず、３月現在KOマウスのホモ接合体が得られていない。そのため、これらのKOマウスの解析が進んでいない。２．脊髄発達過程におけるGABAシグナルの発達変化（Kosaka et al. 投稿中）、Calbindinなどマーカー分子を用いた各種ニューロンの発生変化、後根からの知覚入力の発達変化等の解析方法は確立し、KCC2 KOマウスでは、現在のところ形態学的異常が発見されていない。３．ホモ・マウスが安定して繁殖すれば、直ぐに解析がスタート出来る状態にある。
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| 今後の研究の推進方策 |
１．GAD 65/67（GABA合成酵素の２種類のアイソフォーム）double KOマウス、VGAT（GABA小胞関連タンパク質）KOマウスの系統維持に努める。２．GAD65/67 double KOマウス、VGAT KOマウスの解析を本格化する。(1) GABAシグナルの発達変化の異常を解析する。プレシナプス：伝達物質（GABA、グリシン）と合成酵素、小胞関連タンパク質、ポストシナプス：GABA受容体サブユニット、受容体関連タンパク質、シナプス形態 (2) 脊髄を構成するニューロンの発生・局在の異常を解析する。脊髄ニューロンのマーカーである各種転写因子(Evx1, En1, Lhx3, Chx10, GATA2/3, Sim1)を用いて免疫組織化学的に染色し、ニューロンの分化、細胞移動の異常の有無を明らかにする。(3) ニューロン形態の異常を解析する。Calbindinなどのマーカータンパクの免疫組織化学を行い、細胞の形態（樹状突起など）、軸索の分布の異常を解析し、神経分化の異常の有無を明らかにする。(4) シナプス構築を解析する。興奮性（VGluT）、抑制性(VGAT)、カテコールアミン系(TH, Serotonin)シナプスを免疫組織化学的に染色し、シナプス形成に異常が有るか否かを明らかにする。(5) 後根入力線維の異常を解析する。substance P, CGRPなどの抗体を用いて後根線維を染色し、入力線維の異常の有無を明らかにする。３．KCC2 KOマウス結果との比較 以上を通じて、GAD65/67doubleKOマウスに見られる異常を特定し、GABAの興奮性作用について明らかにする。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
１．マウスの系統維持費用２．マーカー分子の抗体３．GABAシグナルに関連する分子の抗体作製費用４．試薬一般
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