ウイルスベクターとジンクフィンガーヌクレアーゼを用いた高効率相同組み換え法の開発

2013 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 23500491
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 山口 智之 東京大学, 医科学研究所, 助教 (80392158)
• キーワード: ZFN / TALEN / Cas9/CRISPR / レンチウイルスベクター / 相同組み換え

研究概要

ZFNやTALENとはゲノム上の任意の場所の両側数塩基に特異的に結合できるよう人工的に合成されたDNA結合タンパク とFokI 制限酵素のエンドヌクレアーゼ領域を結合させたキメラヌクレアーゼである。本研究ではHIVインテグラーゼとこれら人工ヌクレアーゼの融合タンパク質をレンチウイルスベクター粒子内に封入し、相同組み換えドナーを組み込んだレンチウイルスベクターがゲノム上の標的領域に挿入されるようなベクターシステムの開発を目標としている。　昨年度までにすでに報告されているOPEN methodによってZFNを作製することに成功したが、その後ZFNよりも活性が強く作製も簡単なTALENが報告された為、こちらを実験に用いた。　インテグラーゼとTALENの融合タンパクのnuclease活性を確認し、レンチウイルスベクターに封入して細胞に感染させたが、標的部位への挿入は確認できなかった。　これはヌクレアーゼの活性に必要な左右二つのヌクレアーゼを効率良くウイルス粒子に取り込めなかった、またはタンパク質でウイルス粒子内に取り込まれたヌクレアーゼは活性が必要十分ではなかったことが原因であると考えられる。
近年Cas9/CRISPRシステムという新しいヌクレアーゼシステムが開発された。　このシステムではタンパク質ではなくRNAが鋳型に結合し、そこに導かれたヌクレアーゼがゲノムを切断する。　このシステムは上記の実験結果を克服できる可能性があると考えた。レンチウイルスベクターにヌクレアーゼであるCas9と鋳型に導くガイドRNAを組み込み、感染させたところ、非常に効率良く標的部位を切断することができた。　このシステムを利用すれば通常の遺伝子導入法では導入困難なPrimaryの細胞にも効率良く変異を導入することができる非常に有意義なシステムである。　現在相同組み換えが可能であるかの検討を行っている。

研究成果

• [雑誌論文] Immortalization of erythroblasts by c-MYC and BCL-XL enables large-scale erythrocyte production from human pluripotent stem cells. (2013)
  • 著者名/発表者名: Hirose S, Takayama N, Nakamura S, Nagasawa K, Ochi K, Hirata S, Yamazaki S, Yamaguchi T, Otsu M, Sano S, Takahashi N, Sawaguchi A, Ito M, Kato T, Nakauchi H, Eto K.
  • 雑誌名: Stem Cell Reports. 巻: 1 ページ: 499-508
  • 査読あり
• [雑誌論文] Recurrent mutations in multiple components of the cohesin complex in myeloid neoplasms. (2013)
  • 著者名/発表者名: Kon A, Shih LY, Minamino M, Sanada M, Yamaguchi T, Otsu M, Obara N, Sakata-Yanagimoto M, Nakamaki T, Ishiyama K, Nolte F, Hofmann WK, Miyawaki S, Chiba S, Mori H, Nakauchi H, Koeffler HP, Aburatani H, Haferlach T, Shirahige K, Miyano S, Ogawa S.
  • 雑誌名: Nat Genet. 巻: 45 ページ: 1232-1237
  • 査読あり
• [雑誌論文] Generation of transgenic mouse line expressing Kusabira Orange throughout body, including erythrocytes, by random segregation of provirus method. (2013)
  • 著者名/発表者名: Hamanaka S, Ooehara J, Morita Y, Ema H, Takahashi S, Miyawaki A, Otsu M, Yamaguchi T, Onodera M, Nakauchi H.
  • 雑誌名: Biochem Biophys Res Commun. 巻: 435 ページ: 586-591
  • 査読あり
• [雑誌論文] Generation of Engraftable Hematopoietic Stem Cells From Induced Pluripotent Stem Cells by Way of Teratoma Formation. (2013)
  • 著者名/発表者名: Suzuki N, Yamazaki S, Yamaguchi T, Okabe M, Masaki H, Takaki S, Otsu M, Nakauchi H.
  • 雑誌名: Mol Ther. 巻: 21 ページ: 1424-1431
  • 査読あり
• [雑誌論文] Blastocyst complementation generates exogenic pancreas in vivo in apancreatic cloned pigs. (2013)
  • 著者名/発表者名: 5. Matsunari H, Nagashima H, Watanabe M, Umeyama K, Nakano K, Nagaya M, Kobayashi T, Yamaguchi T, Sumazaki R, Herzenberg LA, Nakauchi H.
  • 雑誌名: Proc Natl Acad Sci U S A. 巻: 110 ページ: 4557-4562
  • 査読あり
• [学会発表] 異種動物体内での臓器構築 (2014)
  • 著者名/発表者名: 山口智之
  • 学会等名: 第13回日本再生医療学会
  • 発表場所: 京都国際会議場
  • 年月日: 20140305-20140305
  • 招待講演
• [学会発表] リプログラマブルラットを用いたin vivo リプログラミングの解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 山口智之
  • 学会等名: 学友会セミナー
  • 発表場所: 東京大学医科学研究所
  • 年月日: 20140203-20140203
  • 招待講演
• [学会発表] 異種動物体内を利用した多能性 幹細胞からの臓器、組織再生法 (2013)
  • 著者名/発表者名: 山口智之
  • 学会等名: 第84回日本動物学会
  • 発表場所: 岡山大学
  • 年月日: 20130926-20130928
  • 招待講演