| 研究課題/領域番号 |
23500511
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| 研究機関 | 群馬大学 |
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研究代表者 |
吉原 利忠 群馬大学, 工学(系)研究科(研究院), 助教 (10375561)
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| 研究期間 (年度) |
2011-04-28 – 2014-03-31
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| キーワード | 蛍光 / りん光 / 酸素 / イリジウム錯体 / 細胞 / レシオ |
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| 研究概要 |
本研究は，細胞内の酸素濃度および濃度分布を高感度，非侵襲的にリアルタイムイメージング，計測するための蛍光・りん光同時発光型分子酸素計を開発することである。本年度は，青色蛍光を示すクマリン系蛍光色素であるC343と，赤色りん光を示すイリジウム錯体であるBTPをプロリン残基数4のオリゴプロリンリンカーで結合させたC343-Pro4-BTPの合成を行った。開発したC343-Pro4-BTPは，アセトニトリル中においてC343由来の蛍光とBTP由来のりん光が同時に観測された。また，溶液中の酸素分圧をマスフローメーターで0-160mmHgの範囲で変化させたところ，C343の蛍光強度は一定の値を示したのに対して，BTPのりん光強度は，酸素分圧の増加ともに減少を示した。さらに，酸素分圧に対して（蛍光強度）/（りん光強度）をプロットすると直線関係が得られ，傾きからStern-Volmer定数（K）を決定した。同様な実験をリン脂質膜存在下においても行ったところ，レシオ測定が可能であることが明らかとなった。ここで，アセトニトリル中とリン脂質膜中でのK値は異なっていた。これは，溶液中と膜中で酸素濃度と酸素拡散定数が異なることを意味しており，今後さらに研究を実施することが必要である。 20％および2.5％酸素条件下で培養したHeLa細胞にC343-Pro4-BTP溶液を添加し，2時間培養後，蛍光顕微鏡で観察をおこなったところ，C343に由来する蛍光は，培養酸素濃度に依存しないのに対して，BTPに由来するりん光は，2.5％酸素条件下において，20％酸素条件下よりも増加した。以上のことより，開発したC343-Pro4-BTPは，生細胞内においてもレシオプローブとして機能することが明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究は，細胞内の酸素濃度および濃度分布を高感度，非侵襲的にリアルタイムイメージング，計測するための蛍光・りん光同時発光型分子酸素計を開発することである。本年度は，蛍光団として青色蛍光を示すクマリン色素（C343）とりん光団として赤色りん光を示すイリジウム錯体（BTP）をプロリンリンカーで結合させたC343-Pro4-BTPの合成を行なった。C343-Pro4-BTPは405nm光励起によって，アセトニトリル中およびリン脂質膜中において蛍光とりん光が同時に観測された。また，系中の酸素分圧を変化させて発光スペクトル測定を行ったところ，C343由来の蛍光は酸素分圧に対して一定強度を示したのに対して，BTP由来のりん光は，酸素分圧の増加に伴い減少した。C343-Pro4-BTP溶液をHeLa細胞の培地に添加し，蛍光顕微鏡で観測した結果，細胞内から蛍光とりん光が観測され，さらに，りん光強度は低酸素培養条件で増加した。 以上の結果より，C343-Pro4-BTPは，蛍光とりん光のレシオ比を利用することにより，溶液，脂質膜，細胞中の酸素濃度を定量的に解析できるプローブ分子であることがわかり，本年度の目標に到達している。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度開発したC343-Pro4-BTPは，生細胞内において酸素濃度に依存して，蛍光に対するりん光強度比が変化することは確認できたが，細胞親和性が低いことが課題としてあるため，この点を改良するための研究を進める。また，C343は青色蛍光を示す蛍光色素であるが，今後は緑色蛍光を示す蛍光色素でもレシオ型酸素プローブとして機能するかの検討を行う。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
平成２３年度は，目的化合物の合成が予想以上に進展したため，試薬，消耗品費の使用が予定よりも少なくなり，その差額を平成２４年度の試薬，消耗品費に充てる。平成２４年度は，細胞親和性の高いレシオ型酸素プローブ分子の開発のための試薬，溶媒，およびプローブ分子の溶液，脂質，細胞内評価について，差額分を含めて消耗品費として研究費を使用する。また，研究成果発表のための旅費として研究費を使用する。
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