研究課題
本研究ではグレリン加齢EGFPマウスを作出し、グレリン細胞の機能解析を試みている。本年度は、シングルセル技術の改善と分泌実験に使用するためのEGFP陽性細胞の抽出技術の確立を行った。しかし、EGFPの発現量が低いため、セルソーターでの検出レベルで回収可能な細胞数が分泌実験を実施するために十分では無かった。また動物実験施設の改修に伴う飼育数の制限により、繁殖を継代維持にとどめたため、シングルセルでの解析技術の確立に重点を置き実験を実施した。グレリン細胞は、脂肪酸、糖等の末梢エネルギー情報を受容して分泌が変化することが示された。さらに他の消化管ペプチドの情報も受容しており、肥満で分泌が減少する原因として、短期的には消化管ペプチドの分泌刺激が、また長期的には糖や脂肪酸等が高濃度で存在することが、その一因であることが推察された。肥満動物ではグレリンの摂食亢進作用が消失しており、過食の原因ではないが、成長ホルモン分泌機能は残存しており、循環グレリンの濃度の減少が、成長ホルモンの分泌を低下させ、脂肪分解に働く成長ホルモン機能を阻害する可能性が示された。またグレリンは、エネルギー代謝を抑制するが、肥満動物ではこの抑制機能が消失していた。エネルギー過多の状態では、グレリンの摂食亢進作用とエネルギー抑制機能を消失させることで、合目的的にエネルギー蓄積を予防している可能性が示唆された。またグレリンは、初期肥満では機能が残存しており、投与後の運動量も亢進する。このことは、肥満初期にグレリンシステムを健全に保つことが、肥満への移行を阻止し、病態の悪化を予防する手段となり得ることを示唆する。グレリン投与は肥満者には、成長ホルモン分泌刺激剤として、また初期肥満では、グレリンシステムの健全化を介して、肥満の治療に結びつく可能性が示唆された。
3: やや遅れている
グレリンEGFPマウスの作出に成功し、現在単離細胞の解析を進めているが、蛍光蛋白の発現量が十分でないため、大規模なグレリン細胞の分泌実験には着手できない状況にある。現在、単離細胞個別のパッチクランプやセカンドメッセンジャーシグナルの解析によって細胞の特徴を解析する手法を確立し、解析を進めている。また、さらにGFPの発現効率の高い系統の作出を行っており、年度中に分泌実験とその結果を明らかにする。
最終年度の本年は、老化マウスの解析と運動によるグレリン細胞の特性の変化の検証を行う。現在作成中の、グレリンEGFPマウスを用いて、若齢非運動群、若齢運動群、高齢非運動群、高齢運動群からグレリン細胞を採取し、分泌機能解析、細胞膜電気情報解析、細胞内シグナル解析を実施する。グレリン欠損マウスとグレリン受容体欠損マウスは、誕生からグレリンシステムを持たずに生存可能な個体であるため、現在、明確な表現型が観察されない。内因性のグレリン機能を解析するため、アデノウィルスにグレリンおよびグレリン受容体遺伝子を組み込み、それぞれの欠損マウスの胃もしくは迷走神経節に投与することで、グレリンの本質的な役割を解明する。肥満や老化でのグレリンシステムの低下解析のため、胃小窩stem cellsからグレリン細胞への分化誘導を解析し、肥満や老化がどの過程に障害を与えているかを明らかにし、その障害を除去することによってグレリンシステムが改善するか検証する。
本年度は、Tg動物の作出費とgenotyping試薬を必要とする。胃単離細胞の試薬、セルソーター関連消耗品、マイクロアレイ解析費、細胞培養試薬と器具、real-time PCR消耗品を必要とする。アデノウィルスへのグレリン遺伝子およびグレリン受容体遺伝子導入に必要な消耗品を購入する。グレリン蛋白の免疫学的測定のための免疫染色、ウェスタンブロット用の試薬を必要とする。成果発表として、学会発表旅費および論文投稿費用を必要とする。
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