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2012 年度 実施状況報告書

線虫を用いたRASSFと相互作用するチェックポイント分子の探索

研究課題

研究課題/領域番号 23501272
研究機関立命館大学

研究代表者

堀 利行  立命館大学, 生命科学部, 教授 (70243102)

研究分担者 井上 英樹  立命館大学, 生命科学部, 助教 (20550156)
キーワードRasf-1 / Rab-39 / Rif1 / Rassf1A / チェックポイント / DNA合成阻害
研究概要

RASSFの線虫ホモローグT24F1.3(Rasf-1と命名)と相互作用する分子をyeast two hybrid systemを用いてスクリーニングすることにより、rab-39、rab-1、F11E6.7 (Rif1)を同定した。このうち、rab-39については、線虫の酸化ストレス応答経路において、T24F1.3とRAB-39が同一の経路上に存在していることを明らかにするとともに、哺乳類のRASSF1AととRab-39との相互作用を確認し、これらの分子間の相互作用は種を越えて保存されていることを明らかにした(Genes to Cells 18:203-210, 2013)。
一方、Rif1に関して、酵母ではテロメア長の制御に関わっているが、哺乳類においてはDNA二本鎖切断で誘導されるATMキナーゼに依存してDNA損傷部に集積し、細胞周期S期のチェックポイント機構に関与することが報告されている。RASSFもRif1同様、ATMキナーゼの介するチェックポイントの活性化に関わることから、RASSF/RASF-1とRif1/F11E6.7が相互作用する蓋然性が高いと推理した。そこでまず、共免疫沈降法により哺乳類細胞内におけるRASSF1A/RASF-1とRif1/F11E6.7の相互作用を調べた。その結果、線虫のRASF-1とF11E6.7の相互作用はin vitroで確認するのが困難であったが、ヒトのそれぞれの相同体であるRASSF1AとRIF1の相互作用が確認された。さらに、線虫個体におけるF11E6.7の機能を調べるために、C.elegansのF11E6.7変異型と野生型を用いて、幼虫および卵をhydroxyureaの存在下に培養してそれぞれの寿命および卵の孵化率を比較したところ、野生型に比較して変異型では寿命と卵の孵化率が有意に低下していた。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

線虫のRASSFホモローグであるT24F1.3(rasf-1)をbaitとして得られた候補遺伝子のうち、rab-39については、線虫の酸化ストレス応答においてT24F1.3と同一のシグナル伝達経路上に存在していることを明らかにし、これらの分子間の相互作用が種を越えて保存されていることと合わせて論文にまとめることができた(Genes to Cells 18:203-210, 2013)。F11E6.7(Rif1)については、HEK293T細胞への一過性発現系でRasf-1との相互作用を確認できなかったが、それぞれのヒトホモローグ間の相互作用は確認できている。以上より、おおむね順調に進展していると言うことができる。

今後の研究の推進方策

F11E6.7とT24F1.3のそれぞれの変異型およびfeeding RNAiによるそれぞれのノックダウン実験を組み合わせて、さまざまなDNA障害を起こす薬剤の存在下に卵の孵化や幼虫の寿命を比較してepistasis解析を行い、これらの遺伝子が機能的に関連しているかどうかを調べる。また、ヒトの培養細胞を用いて、siRNAやshRNAによってRif1およびRASSF1Aのノックダウンを行って、機能的関連性を検討する。

次年度の研究費の使用計画

平成24年度は小額の未使用金が生じた。必要な実験備品はほぼ揃っているので、繰り越し金と合わせて研究費は主に消耗品費および研究成果発表のために使用する予定である。

  • 研究成果

    (4件)

すべて 2013 その他

すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件) 学会発表 (3件)

  • [雑誌論文] C. elegans Rassf homolog, rasf-1, is functionally associated with rab-39 Rab GTPase in oxidative stress response.2013

    • 著者名/発表者名
      Motohiko Takenaka, Hideki Inoue, Atsushi Takeshima, Tomonori Kakura, and Toshiyuki Hori
    • 雑誌名

      Genes to Cells

      巻: 18 ページ: 203-210

    • DOI

      10.1111/gtc.12028

    • 査読あり
  • [学会発表] TRIM/RBCC protein, TRIM3, regulates localization of Yes-associated protein 1 (YAP1)

    • 著者名/発表者名
      Hideki Inoue, Tomonori Kakura, Motohiko Takenaka, Atsushi Takeshima and Toshiyuki Hori
    • 学会等名
      第71回日本癌学会学術総会
    • 発表場所
      ロイトン札幌、北海道
  • [学会発表] TRIM/RBCC タンパク質TRIM3 はYAP の局在転移を介してHippo 経路シグナルに 影響する

    • 著者名/発表者名
      竹島 淳史, 井上 英樹, 香座 知典, 道上 康平, 渡辺 大悟, 堀 利行
    • 学会等名
      第35回日本分子生物学会年会
    • 発表場所
      福岡国際会議場、福岡県
  • [学会発表] TRIM/RBCC E3 リガーゼ、NHL-1/TRIM3 はDAF-16/FOXO タンパク質の安定化を 介してinsulin/IGF シグナルを制御する

    • 著者名/発表者名
      井上 英樹, 香座 知典, 竹島 淳史, 堀 利行
    • 学会等名
      第35回日本分子生物学会年会
    • 発表場所
      福岡国際会議場、福岡県

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公開日: 2014-07-24  

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