| 研究概要 |
DNA二重鎖切断（DNA double-strand break、以下DSB）は最も重篤な細胞障害の一つであり、その速やかな修復は細胞の恒常性維持に重要である。DSB修復には相同組換えと非相同末端連結（Non-homologous end-joining、以下NHEJ）の二つの分子機構が主要な役割を担っている。本研究ではNHEJの基本因子に着目し、それらの機能解析を行った。XLFはNHEJ基本因子であり、DSBが細胞内に生じると速やかに損傷部位へ集積する。放射線高感受性遺伝病患者から見出された一アミノ酸置換を持つXLFはユビキチン化とそれに伴うプロテアソームによる分解を受けることを明らかにしてきたが、そのユビキチン化部位を解析するため、一連の欠失体を作成し、これを用いてユビキチン化部位が生じる領域を限局した。この領域内のリジン残基をアルギニンに置換した変異体を作製し、現在、ユビキチン化部位の同定を進めている。またこれまで外部施設で実施してきたライブイメージング解析を自らの研究施設で実施できるように、パルスレーザーによるDNA損傷誘導とライブイメージングを実施するための装置を導入した。NHEJの制御にイノシトール６リン酸（IP6）が関与することが無細胞系の解析から示唆されてきたが、細胞内環境におけるイノシトール代謝系がNHEJに与える影響を解析するため、イノシトール5リン酸（IP5)からIP6への合成を触媒する酵素であるInositol 1,3,4,5,6-Pentakisphosphate 2-KinaseならびにIP5の合成を触媒する主要酵素であるInositol polyphosphate multikinaseのcDNAを取得した。これらにGFPを付与した発現プラスミドを構築し、パルス照射によるDNA損傷誘導時の細胞内タンパク質挙動のライブイメージング解析を実施した。その結果、これらの酵素自体はDSB部位に直接は作用せず、代謝産物の核内拡散がNHEJに影響を及ぼしている可能性が強く示唆された。
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