| 研究課題/領域番号 |
23510067
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| 研究機関 | 金沢医科大学 |
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研究代表者 |
橋本 光正 金沢医科大学, 一般教育機構, 准教授 (70293975)
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| キーワード | 53BP1 / Rad18 / TRF2 / DNA二重鎖切断端 / テロメア / CO-FISH / テロメア末端姉妹染色体分体組換 / 末端結合修復 |
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| 研究概要 |
研究の目的及び研究計画に記載した概要（下記）
53BP1は、特にG1期細胞において、DNA二重鎖切断(DSB)の非相同末端結合修復に関与する。本研究は、テロメア非保護DNA断端の運動性を指標として、53BP1がどのようにして非相同末端結合修復活性を亢進させているのか、Rad18の関与はどうか、を検討し、非相同末端結合修復の全経路を明らかにする。
研究成果
1. 非保護テロメア端の末端結合修復と53BP1、Rad18の関係 ①実験系の構築について、染色体末端結合修復について、その結合の方式を定量的に評価する系を構築した。具体的には染色体末端保護タンパクTRF2のsiRNAを用いて染色体末端を露出した状態を誘導し、その末端の結合修復活性をTelomeric PNA FISHを用いて定量的に測定する系を構築した。②53BP1-/-MEF、Rad18-/-MEF、野性株MEFを用いた非保護テロメア端の結合能についてRad18-/-MEFは野性株MEFと同等の結合能を示すが、53BP1-/-MEFは著しく低下することを示した。
2. 非保護テロメア端の末端結合修復と細胞周期依存性 ①Chromosome Orientation (CO)-FISHによる末端結合の細胞周期依存性、CO-FISHを用いて、末端結合の細胞周期依存性を検討した。その結果、Rad18-/-MEF、野性株MEFにおいて、末端結合の約80％はcromosome type、約20％はchromatide typeの結合であった。②53BP1-/-MEFにおいて、CO-FISHの結果から、T-SCE(テロメア末端姉妹染色体分体組換)が高頻度に起こることがわかった。このことは、極めて相同性の高い部位における組換修復の機構を検討する上で重要な知見を与えてくれるものと考えられる。現在、このメカニズムについて検討している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
申請時点に考えた実験系の構築は予想通りの進行となった。Telomere RPA FISH、Chromosome Orientation FISH(CO-FISH)による染色体末端結合能の解析および染色体末端の変異解析は予定通り進行した。
Rad18-/-MEFと53BP1-/-MEFにおいて、申請時点に予想した実験結果とは異なる結果が得られたが、その実験結果はDNA二重鎖切断の修復モデルを考える上で、新しい機構を想起させるものであった。その結果を基に、新しい機構モデルを立てて、それを検討中したが、仮説モデルの構築もしくはその証明に支障があり、研究目的の達成に、若干の遅れが生じている。
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| 今後の研究の推進方策 |
53BP1-/-MEFにおいて高頻度に観察されたT-SCEについて、その機構を明らかにすること。具体的には、現在、構築中あるいは構築済みの53BP1機能ドメインは細胞に戻し、T-SCEを調べ、その機構を担う部位を明らかにする。
次に53BP1の上流経路にあるタンパク質と下流経路にあるタンパク質に対して、それぞれsiRNAを導入し、その後テロメア末端露出のためのsiRNA(TRF2)を処理、染色体解析を行う。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
予定通り、物品費として充てる。購入品としては、培養生物に関するもの、分子生物学実験に関するもの、蛍光顕微鏡などに適宜充当する計画である。
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