ＵＶＡ光反応によるニトロソアミン類のＤＮＡ・蛋白・生体膜傷害とシグナル伝達擾乱

2012 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 23510075
• 研究機関: 岡山大学
• 研究代表者: 有元 佐賀惠 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 准教授 (90212654)
• キーワード: ニトロソプロリン / UVA / DNA付加体 / ヌクレオチド付加体 / 光化学反応 / 一酸化窒素 / DNA損傷 / 8-オキソグアニン

研究概要

ニトロソ化アミノ酸・ニトロソアミン類のUVA光活性化による化学修飾を解析し、損傷部位の構造を明らかにするために、まずDNAのモデルとして、デオキシヌクレオチドに対するニトロソプロリン(NPRO)のUVA光反応を解析した。UVA照射したNPROから一酸化窒素(NO)放出が見られ、dGとNPROの光反応で8-オキソデオキシグアノシン(8-oxodG)，デオキシキサンチン，デオキシオキザノシンに加えて新たな反応物が検出された。単離同定研究の結果、(R)-,(S)-8- (2-pyrrolidyl)-dG (G1, G2)と構造決定した。また、dAとNPROの好気下での光反応生成物を解析したところ、デオキシイノシンとdAの２位置換体(R)-,(S)-2-(2pyrrolidyl)-dA (P1, P2)を単離同定した。一方、dAとNPROの嫌気下での光反応では新たな反応物が検出され、単離同定研究の結果、８位置換体(R)-,(S)-8- (2-pyrrolidyl)-dA (A1, A2)と構造決定した。これは好気下ではdGやdAの８位は酸素ラジカルの付加による8-oxodGの生成の方が優先するためではないかと考えられ、エネルギー移動によるタイプI型付加反応と、活性酸素種の関与するタイプII型反応が競合している可能性が考えられる。さらに、光活性化NPRO はDNAと反応し、上記の付加体(G1, G2, P1, P2, A1, A2)を生じることが分かった。また、チロシンやグルタチオンがNPROの光反応によりニトロチロシンやS-ニトログルタチオンとなることが分かった。また、ヒト由来表皮ケラチノサイト細胞NCTC2544が、NPROのUVA光反応により、用量依存的にDNA損傷を起こし小核形成することが分かった。同時に、細胞培養液に用量依存的に一酸化窒素が検出されることも分かった。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

２4年度の目標 (1) NPROの光活性化によるDNA損傷の解析：　核酸モデルとしてのヌクレオシドに対する損傷解析をおこない，既知の付加体に加えて、新規核酸付加体６種類が生じることを見出し、付加体の化学構造を同定した。さらに、光動力学特性を明らかにするために、NPROの光吸収のある400nm以下の単波長光を照射し，それぞれの波長におけるデオキシグアノシンへの付加体形成がNPROの光吸収曲線に沿い、NPROの光吸収が律速であることが明らかとなった。また、DNAとのNPROの光反応を解析し、DNA上でもヌクレオシドモデルで見られた付加体形成が起きていることを見出した。
目標(2) ヒト由来皮膚培養細胞に対する光毒性解明：　ニトロソプロリンが血液を介して全身循環し、太陽光などのUVA照射部位で毒性を発揮するというモデルから、皮膚表皮系細胞でのモデル研究が適当と考えた。そこで、ヒト由来表皮ケラチノサイト培養細胞を使った光遺伝毒性検出系の確立を行い、NCTC2544細胞およびHaCaT細胞による検出系を確立した。これによりDNAやタンパクの損傷解析と同時に遺伝毒性検出を行う系を確立した。このヒト由来表皮培養細胞に対し光活性化したNPROが光遺伝毒性を示すことを明らかとした。
目標(3) 細胞膜・脂質環境および生体膜モデルでの光反応解析：　脂質のモデルとして不飽和脂肪酸中でのNPROの活性化を解析したところ、UVA照射により一酸化窒素の発生・変異原性生成が起きることを見出したので、脂質環境中でも光反応が起きることが分かった。
以上より、おおむね順調に達成できたと考える。

今後の研究の推進方策

得られた結果をもとに、研究をさらに進める。特に、DNA損傷解析ならびにタンパク付加体の構造解析をさらに進める。また、皮膚モデルとしてのケラチノサイト培養細胞におけるニトロソ化アミノ酸・ニトロソアミン類とUVAの複合作用による光毒性・炎症性反応誘起・シグナル伝達異常への関与を明らかにする。また、ヒト由来培養細胞におけるシグナル伝達を解析する。たとえばNPROのUVA分解による一酸化窒素放出によるグアニル酸シクラーゼ活性化による細胞内cGMP濃度上昇を測定するなど、酵素活性や遺伝子発現への影響を解析する。さらに、光動力学特性を明らかにするために、NPROの光吸収のある400nm以下の単波長光を照射し，それぞれの波長におけるDNA損傷量、タンパク損傷量、シグナル分子変化量、その他の細胞影響を定量し、波長特性を明らかにする。
（2）皮膚におけるNPROの光毒性を解析するため、動物モデルとして、ヘアレスマウスあるいは背中の毛を剃ったマウスを麻酔しておき、ニトロソアミン類・ニトロソアミノ酸を皮膚に塗布し、UVAを照射する。遮蔽を利用したスポット照射を行うことにより、照射部位と非照射部位の炎症反応等を同一個体内で比較する。また、マウスの照射部位および非照射コントロールの皮膚をとり、皮膚細胞のa)細胞損傷、とくに細胞致死(ネクロシス)作用およびアポトシス誘導、b)炎症性メディエーター誘導、c)シグナル伝達などの酵素のリン酸化異常、d)タンパク発現異常などを解析する。また，DNAを抽出し，DNA損傷をLC-MSMS解析する。また，長期毒性試験として、処理マウスと対照マウスでの皮膚腫瘍発症を比較研究する。
（３）細胞膜・脂質環境および生体膜モデルでの光反応解析を行い、光反応に伴い生じるDNAや膜脂質・タンパクの損傷分子を解析する。

次年度の研究費の使用計画

１）設備備品の購入は計画していない。（２）消耗品費として、試験研究に必要な試薬器具を購入する。すなわち、DNA解析に必要な液体クロマトグラフィー試薬、細胞培養に必要な培養試薬やプラスチック器具を購入する。また、細胞内のシグナル伝達等の検出キット、一酸化窒素定量キットなどを購入する。さらに実験動物としてマウスを購入する。以上の計画である。（３）旅費として、研究情報収集のため、第35回日本光医学・光生物学会（浜松・1泊２日）参加を計画している。（４）また、DNA損傷やタンパク・アミノ酸損傷解析に必要な測定機器、とくにLCMSMS等の使用料を支払う計画である。また、実験動物施設の使用料を支払う計画である。
以上で今年度分、ほぼ全額が必要になると計画している。

研究成果

• [学会発表] UVA活性化N-ニトロソプロリンによる新規核酸付加体 (2012)
  • 著者名/発表者名: 有元佐賀惠、青山周平、田中範子、佐野嘉容子、根岸友恵、波多野力、鈴木利典、木村幸子
  • 学会等名: 第33回日本光医学・光生物学会
  • 発表場所: 神戸市
  • 年月日: 20120727-20120728