| 研究課題/領域番号 |
23510139
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| 研究機関 | 独立行政法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
青木 弘良 独立行政法人理化学研究所, 超精密加工技術開発チーム, 協力研究員 (50518636)
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| 研究分担者 |
池 郁生 独立行政法人理化学研究所, 実験動物開発室, 専任研究員 (40183157)
新谷 政己 静岡大学, 工学部, 准教授 (20572647)
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| キーワード | マイクロ流路 / ナノファイバー / 一菌体ゲノム増幅 / 難培養微生物 |
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| 研究概要 |
１．一菌体分離・ゲノム増幅チップ用送液系の構築
マイクロ流路内で微生物菌体を視認し，目的の微生物を単離するために，送液系の開発を行った．約50×50μm径のシリコーンマイクロ流路に対し，250μL容のガラスシリンジによるシリンジポンプを用いて蛍光ビーズを送液した．送液速度100 nL/min以上で蛍光ビーズは安定に流れたが，高速に送液され，顕微鏡下での視認は困難だった．一方100nL/min以下では高い内部配管抵抗により，送停止を繰り返した．そこで電気泳動および静水圧（注入口と排出口の液面差）を用いて蛍光ビーズの送液を検討した．その結果，電気泳動および静水圧とも，視認可能な約200μm/sで蛍光ビーズを送液できた．
２．ゲノム分離用ナノファイバー膜の作製
単離した菌体は，流路内に設置したナノファイバー膜上に保持し，アルカリ溶菌，中和，およびゲノムDNAの酵素増幅を行う．ナノファイバー膜は架橋剤無しに耐水性，耐アルカリ，および低蛍光で，菌体およびゲノムDNAを保持できる十分に小さい口径を持たなくてはならない．そこで耐水性をもち，低蛍光のポリビニルブチラール(PVB)に着目し，エレクトロスピニングにより約3μm厚の薄いPVBナノファイバー膜を作製した．一般にナノファイバー膜は，繊維径が約100nmと微細なものの，繊維間架橋が少なく，架橋剤や熱融着による網目構造がないと分離能が低い．そこでPVBを水に浸漬すると，水に対する反発から圧縮，自己融着し，簡便に網目構造を作製できた．またPVBナノファイバー膜は高い表面積を持ち，高い撥水性を示すが，低濃度の有機溶媒を添加すると撥水性を抑え，水を浸透できた．そこで実際にカバーガラス上の大腸菌上にPVBナノファイバー膜を作製し，アルカリ溶菌，中和，およびDNA蛍光染色を行うと，ナノファイバー下に各菌体のゲノムDNAを安定に保持できた．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
これまでマイクロ流路内で細胞分離を行うセルソーターの報告が行われ，多数の細胞をハイスループットに分離するため，高速な送液と蛍光強度による自動分離技術は研究されていたが，逆に低速での送液は困難だった．しかし電気泳動や静水圧などの簡便な低速送液技術や，分離した菌体を保持しゲノム増幅するナノファイバー膜を開発できたため，最終年度の平成25年度はすみやかに研究を進め，分離技術を確立し，モデル微生物の分離とゲノム増幅を行いたい． および増幅DNAの品質評価を行いたい．
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| 今後の研究の推進方策 |
今年度は比較的制御が簡便な，電気泳動を用いた菌体分離技術の確立した後，（設計済みの）分離用マイクロ流路の作製を作製し，一菌体分離・ゲノム増幅チップシステムを構築する．構築されたシステムを用い，モデル微生物（大腸菌，Pseudomonas，CAR Bacillus）などの一菌体分離とゲノム増幅を行い，定量PCRや次世代シーケンサーによるゲノム解析，およびゲノムタイリングアレイによって，従来法であるバルクで増幅したゲノムDNAと比較することで，本法による増幅バイアスの改善を検証する．
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| 次年度の研究費の使用計画 |
研究の進展が遅れたため，次年度使用額が発生したが，その分と翌年度分として請求した助成金と合わせ，菌体分離用電極および制御回路の開発や，一菌体分離・ゲノム増幅チップシステムの作製，および消耗品として，増幅DNA評価のための，ゲノムワイドの定量PCRのためのプライマーおよび試薬の購入，次世代シーケンサー解析費用に用い，研究の促進を図る．
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