| 研究課題/領域番号 |
23510139
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| 研究機関 | 独立行政法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
青木 弘良 独立行政法人理化学研究所, 光量子工学研究領域, 研究員 (50518636)
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| 研究分担者 |
池 郁生 独立行政法人理化学研究所, バイオリソースセンター, 専任研究員 (40183157)
新谷 政己 静岡大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (20572647)
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| 研究期間 (年度) |
2011-04-28 – 2015-03-31
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| キーワード | 難培養微生物 / アガロースフィルム / 一菌体分離 / 全ゲノム増幅 / レーザーマイクロダイセクション |
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| 研究実績の概要 |
これまで環境中の難培養微生物を，目視下で簡便に単離し，微細な反応槽内での全ゲノム増幅(Whole Genome Amplification, WGA)により，バイアスの少ない増幅DNAを得るマイクロ流体デバイスの開発を行った．本デバイスでは，ナノファイバー膜によるDNA分離により，バルブのない簡便な構造を図った．しかしナノファイバー膜の孔径は約300nmと比較的大きく，抽出時に生じるゲノムDNA断片の分離保持が困難だった．
そこでナノファイバー膜よりも孔径の小さい，アガロースゲル内への菌体の包埋と，レーザーによる菌体の単離を試みた．アガロースゲルに，モデル微生物として大腸菌と，レーザーを吸収する色素を添加した．ゲルは，ハンドリング性向上と切断後の再付着防止のために，乾燥させ，フィルム化した．得られたアガロースフィルムより，Laser Microdissection (LMD)(Leica)で，目視で確認しつつ，一菌体を含む約100 x 100 μmの切片を切り出した．しかしこの切片は乾燥によりアガロース繊維が互いに密着し，高い透明性を示すが，酵素やプライマーが内部に浸透しにくくWGAが困難だった．
そこでアガロース繊維の密着を防ぐ試薬を検討したところ，ポリビニルアルコール (PVA)やポリビニルピロリドン (PVP)の添加により，乾燥後水溶液に浸漬するとPVAやPVPの溶出によりフィルムが膨潤した．そこでこれらのフィルムを用いてWGAを行うと，膨潤によるアガロース孔径の拡大による，フィルム内への酵素やプライマーの拡散により，大腸菌の染色体DNAが増幅された．
以上の結果から，アガロースフィルムを用い，目視下で簡便に菌体を単離し，微細なゲル内で酵素増幅をする系を確立した．今後次世代シーケンサーによる増幅ゲノムDNAのバイアス評価などを行い，本法の有用性について評価したい．
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| 備考 |
本研究課題から得られた成果に対し，2015/5/13 特許出願予定
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