研究概要 |
初年度は、金属置換フィンガータンパク質のデザイン戦略およびその合成手法について検討を行った。基本フレームなる天然亜鉛フィンガータンパク質としてショウジョウバエ由来の転写因子GAGAファクターに含まれる亜鉛フィンガードメイ(GAGA Zf)を用いた。GAGA Zfのフィンガー部分である30残基およびDNA結合能を有する最小単位である50残基のペプチドは、一般的なペプチド固相合成法(Fmoc法)を用いて化学合成し、逆相HPLCにより精製し完全なアポ体を得ることに成功した。また、金属配位部位であるCysやHisを変異させたフィンガードメインも作製した。これらのフィンガードメインに対して種々の金属イオン(Zn(II), Co(II), Ni(II), Cu(II), Fe(II), Cu(I)など)との相互作用を検討した。その結果、Fe(II)およびCu(II)に関しては、いずれの場合も明確な配位結合形成および二次構造誘起が認められなかった。一方、Co(II)およびNi(II)においては、野生型においてのみ結合およびZn(II)と場合と同様の二次構造誘起が認められた。さらにITCおよびCDおよびUV滴定によりGAGA ZfとZn(II),Co(II),Ni(II)との結合定数を決定することできた。さらに、金属置換フィンガーのDNA結合能についても検討を行い通常のターゲット配列であるGAGAG配列に対し、Zn(II)およびCo(II)では同程度の、Ni(II)ではやや親和性が低いものの、いずれの場合も結合することが明らかとなった。また、Co(II)およびZn(II)対しては分子進化的手法であるSELEX法を用いて金属置換による配列選択性の許容性についても検討を始めている。
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