| 研究課題/領域番号 |
23570043
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
初谷 紀幸 北海道大学, 医学(系)研究科(研究院), 特任助教 (90456848)
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| 研究期間 (年度) |
2011-04-28 – 2013-03-31
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| キーワード | 植物免疫 / ATP / 細胞死 / イメージング |
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| 研究概要 |
アデノシン三リン酸（ATP）は細胞のエネルギー通貨として、また、シグナル分子として、生体のなかで重要な役割を果たしている。本研究の目的は、蛍光ATPプローブを用いて、"生きた"植物細胞におけるATPの空間分布や動態といったATPについての基本的な知見を明らかにした上で、病原体の感染に応答した細胞内および細胞外のATP濃度変化を追跡し、抵抗性発現に関わる細胞死シグナルとしてのATPの役割・制御機構を明らかにすることである。 23年度は、本ATPプローブを発現するシロイヌナズナ形質転換体を作出した。この植物を用いることによって、細胞の形態とATP濃度の増減を"生きたまま"リアルタイムに可視化することに成功した。具体的には、定常状態における細胞では蛍光ATPプローブのシグナルは細胞内で隔たりはなく、ATPは細胞質で均一に分布していることを明らかにした。細胞死を誘導した細胞のATP濃度の変化を調べるため、蛍光ATPプローブを発現するシロイヌナズナに非親和性細菌Pseudomonas syringae pv tomato (Pst) DC3000/avrRpm1を接種し、タイムラプス蛍光イメージングを行った。その結果、接種後数時間で細胞内のATP濃度が増加することを見いだした。細胞内ATP濃度は、その後、細胞が細胞死特有の形態変化を示すのと前後して、急激に低下しはじめた。一方、細胞死を誘導しない親和性細菌Pst DC3000を接種した場合、細胞内のATP濃度はほとんど変化しなかった。これらの結果から、ATPの濃度が低下する前に細胞死が開始されることが分かってきた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
植物細胞死では、細胞内のATP濃度変化が細胞死の実行因子の活性化に繋がることが報告されている。しかし、ひとつひとつの"生きた"細胞のATPの時間的・空間的な分布・変動についての知見はほとんどわかっておらず、従来のATP検出法では不可能であった。バイオイメージングの手法を用いて、細胞の形態とATP濃度の増減を"生きたまま"リアルタイムに可視化することに成功した。交付申請書の実験計画に従って実験を進め、定常状態における細胞内ATP濃度の基本的性質を解析し、細胞内ATP濃度の空間分布を明らかにすることができた。また、非病原性細菌と病原性細菌の感染を受けた植物細胞の形態変化と細胞内ATP濃度の変化を同時にイメージングすることに成功し、ATP濃度変化と植物細胞死の関連性に関する知見が得られつつある。これまにでいくつかの研究成果は、学会や国際シンポジウムで報告した。
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| 今後の研究の推進方策 |
昨年度までに確立した蛍光ATPプローブを発現する形質転換シロイヌナズナおよびタイムラプス蛍光イメージング法を用いて、感染応答過程における細胞内のATPの濃度変化を追跡し、抵抗性発現に関わる細胞死シグナルとしてのATPの役割・制御機構を明らかにする。具体的には、(1)感染細胞内の各コンパートメントの形態変化とATP濃度変化をリアルタイムで同時観察し、感染に伴うATPの空間分布や動態を経時的に追跡する。これにより、生きた細胞内のATP濃度が病原体の感染ストレスに対してどの程度ロバストであるのか、それとも影響を受けやすいのか明らかにする。(2)各種薬剤によってATP合成・分解を阻害・亢進させた場合の病原体感染に対する植物の抵抗性レベルの変化を調べる。過敏感細胞死の誘導、防御タンパク質の発現、活性酸素の生成等、抵抗性反応の諸性質を調べ、抵抗性発現のための細胞内ATPの役割・制御機構の解明を目指す。 自家蛍光を発する植物細胞をイメージング解析する上で有効な発光イメージングの手法を取り入れ、ATPイメージングに応用する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
研究目標を達成するにあたり、新たな知見について詳しく調べる必要が生じたため、研究計画および研究方法を検討・変更した。それに伴い、23年度の一部研究費を次年度に繰り越す必要が生じた。繰り越しする研究費を加えた24年度の研究費における備品・消耗品・旅費・謝金・施設使用料をはじめとするその他の項目は、適正に計上されている。各項目が全研究経費の50%を越えることはない。 設備備品費：23年度までにイメージング解析システムや培養等に必要な装置の設置は完了しているため、設備費の計上は行わない。消耗品：各種抗体や各種薬剤などを購入する。また蛍光シグナルのさらなる向上を目指して適宜蛍光フィルターを購入する。旅費：成果発表のための国内学会旅費および研究打ち合わせのための旅費を支出する。その他：学術論文の投稿のための諸経費、英文校正費用などを支出する。
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