| 研究課題/領域番号 |
23570067
|
|---|
| 研究機関 | 北海道大学 |
|---|
研究代表者 |
勝 義直 北海道大学, 理学(系)研究科(研究院), 准教授 (00332180)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2011-04-28 – 2014-03-31
|
| キーワード | エストロゲン受容体 |
|---|
| 研究概要 |
女性ホルモンであるエストロゲンは、脊椎動物の生殖活動の基盤となるステロイドホルモンである。本研究課題は、このエストロゲンの受容体である「エストロゲン受容体」が生物進化のどの段階から出現したのか、リガンド依存的な転写制御因子としての機能はどのように獲得されたのか、というエストロゲン受容体の成立に関わる根本問題を解決する為に行われている。平成２３年度は生物進化の分岐点に位置する無顎類であるヤツメウナギと軟骨魚類であるゾウギンザメからエストロゲン受容遺伝子の単離を試みた。これまでに脊索動物であるヤツメウナギからエストロゲン受容体遺伝子の単離に成功しているが、リガンドであるエストロゲンとは結合できず、従って転写活性化能を持っていないことが判明している。そこで、平成２３年度はまず最も下等な脊椎動物であると考えられている無顎類のヤツメウナギからエストロゲン受容体遺伝子の単離を試みた。その結果、ヤツメウナギは高等脊椎動物が２種類のエストロゲン受容体を持つのと同様に、２種類のエストロゲン受容体遺伝子を持っていることを世界に先駆けて確認した。それに引き続き、軟骨魚類であるゾウギンザメからも２種類のエストロゲン受容体遺伝子の単離に成功した。これらの結果は、生物が脊椎動物へと進化した際に遺伝子重複によって２種類のエストロゲン受容体が出現したことが示唆される。これまで高等脊椎動物が持つ２種類のエストロゲン受容体遺伝子は生物進化のどの段階で起こった出来事であるのかは、不明であったが今回の結果は脊椎動物への進化と同時に起こったことを物語っており、遺伝子出現という一つの謎が解明されたことを意味すると考えている。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
平成２３年度は本研究課題の初年度であるが、当初計画していた遺伝子単離に成功したことは非常に大きな成果であると考えている。さらに、次年度に予定している単離した遺伝子の機能解析の準備を着実に行っており、平成２４年度の研究計画を遂行するための足場を固めている段階である。これらのことから「当初の計画以上に進展している」と評価している。
|
| 今後の研究の推進方策 |
本研究の今後の推進方針であるが、これまで予定した計画以上に進展していると思われるので、当初の計画通りに進めて行く予定である。具体的には、単離した遺伝子の機能解析である。エストロゲン受容体はヒトなど高等脊椎動物ではリガンドであるエストロゲンに依存した転写調節を行う。そこで、下等な動物から単離されたエストロゲン受容体は(1)リガンドと反応するか、(2)DNAと結合するか、(3)転写活性化能を有するのか、という３点の特徴について調べる。得られたエストロゲン受容体を発現させるベクターとレポーター遺伝子のプロモーター領域にエストロゲン応答配列（ERE配列）を付加したレポーターコンストラクトを培養細胞に導入し、レポータージーンアッセイによりリガンド依存的な転写活性を測定する。エストロゲンのみではなく他のステロイドホルモン等様々なリガンドを用い、リガンド依存的・濃度依存的な転写活性を調べる。このようにエストロゲン受容体のリガンド依存性・特異性それに付随する転写活性を調べる。なお、エストロゲン応答配列と結合できないという結果を得た場合、さらに転写活性を示さない場合は、リガンド結合領域を大腸菌で発現させたリコンビナント受容体タンパク質を用いることにより、リガンドとの直接的な結合をbinding-assayを利用して調べる。また、単離したヤツメウナギ、ゾウギンザメのエストロゲン受容体がエストロゲン応答配列と結合できるかを直接的に調べる。標識したERE配列をもつDNA断片を無細胞系で合成したエストロゲン受容体と混ぜた後、電気泳動をして標識したDNA断片の移動度を調べることにより、タンパク質とDNAとの相互作用を調べる。さらに、培養細胞で作製した受容体タンパク質とDNAとの結合活性法を利用してエストロゲン応答配列との結合能を明らかにする。
|
| 次年度の研究費の使用計画 |
23年度中に納品したが、支払いが次年度以降になったため「ガラスフラスコ」、「pHメータ」及び「プラスミドDNA抽出キット」の支払いに使用する。
|
